Low-Intensity Pulsed Ultrasound Protects Retinal Ganglion Cell From Optic Nerve Injury Induced Apoptosis via Yes Associated Protein

doi:10.3389/fncel.2018.00160

.2018年6月13:12:160。

doi:10.3389/fncel.2018.00160。 2018年eCollection。

低强度脉冲超声通过Yes相关蛋白保护视网膜神经节细胞免受视神经损伤诱导的凋亡

周嘉兴¹, 刘云佳¹, 席晨¹, Xi Zhang（西张）¹, 徐杰（音译）¹, 柯扬², 董旺（Dong Wang）^三 4, 森林¹, 建业¹

附属机构

¹中国重庆陆军医科大学大坪医院外科研究所眼科。
²重庆医科大学儿童医院重庆工程技术中心干细胞治疗，中国重庆。
^三重庆医科大学第一附属医院超声科，重庆，中国。
⁴重庆医科大学附属第二医院超声分子成像重庆重点实验室，重庆，中国。

采购管理信息： 29950973
PMCID公司： PMC6008403型
内政部： 10.3389/fncel.2018.00160

低强度脉冲超声通过Yes相关蛋白保护视网膜神经节细胞免受视神经损伤诱导的凋亡

周嘉兴等。前细胞神经科学. 2018.

.2018年6月13:12:160。

doi:10.3389/fncel.2018.00160。 2018年eCollection。

作者

周嘉兴¹, 刘云佳¹, 席晨¹, Xi Zhang（西张）¹, 徐杰（音译）¹, 柯扬², 董旺（Dong Wang）^三 4, 森林¹, 建业¹

附属机构

¹中国重庆陆军医科大学大坪医院外科研究所眼科。
²重庆工程技术中心干细胞治疗，重庆医科大学附属儿童医院，重庆，中国。
^三重庆医科大学第一附属医院超声科，中国重庆。
⁴重庆医科大学附属第二医院超声分子成像重庆重点实验室，重庆，中国。

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摘要

背景：低强度脉冲超声（LIPUS）已用于临床研究。但对其对中枢神经系统（CNS）的影响或作用机制知之甚少。视网膜神经节细胞（RGCs）是CNS神经元细胞，可以作为一个经典模型系统来评估LIPUS对外伤性视网膜损伤的保护效果。在本研究中，我们的目的是：（1）测定LIPUS的脉冲能量和对RGC存活能力的影响，（2）确定LIPUS在视神经（ON）挤压诱导的视网膜损伤中的保护作用，以及（3）探索LIPUS预防RGC凋亡的细胞机制。方法：建立ON挤压模型，诱导RGC死亡。每天使用LIPUS治疗小鼠眼睛，并解剖视网膜样本进行免疫染色和Western blot。免疫染色和蛋白质印迹检测yes相关蛋白（YAP）和凋亡相关蛋白的表达在体外和中活泼地TUNEL染色评估RGC的凋亡，荧光金和Tuj1抗体分别标记RGC和残留轴突的存活。鱼藤酮被用来建立在体外采用细胞退化模型和siYAP干扰YAP的表达，检测LIPUS的保护作用。结果：LIPUS保护RGC免受丢失和凋亡体内和在体外在LIPUS处理下，裂解/前蛋白酶3的比率也显著降低。作为细胞力学传感器，LIPUS刺激组YAP表达增加，YAP转位到细胞核，但磷酸化YAP降低。当YAP被抑制时，LIPUS不能保护RGC免受caspase3依赖性凋亡。结论：LIPUS在ON挤压模型中阻止RGC凋亡在体外细胞退化模型，这表明了进一步创伤ON损伤的潜在治疗方法。其保护机制依赖于YAP激活，并与caspase-3信号通路相关。

关键词：唇；RGC；YAP；细胞凋亡；视网膜。

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数字

图1
低强度超声对细胞活力有好处体内和*体外试验。* **（A）**LIPUS处理细胞的示例，*在体外*.（B）初级皮层神经元活力和LIPUS输出能量测定(n个= 6).（C）初级RGC活力和LIPUS输出能量测定(n个= 6).（D）LIPUS对小鼠的治疗示例。**（E）**LIPUS剂量依赖性caspase-3激活试验。第7天不同等级LIPUS治疗组中procasase-3和cleaved-caspase-3的表达体内.（F）不同级别LIPUS中procasase-3和cleaved-caspase-3与GAPDH的标准化OD。5级LIPUS触发了更多的劈开血块-3(^∗*P（P）*< 0.05,n个= 4).（G）胱天蛋白酶-3的归一化OD与LIPUS强度呈负相关(对= 0.–0.9014,*P（P）*< 0.0001,n个= 4).（H）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3与强度呈正相关(对= 0.8824,*P（P）*< 0.0001,n个= 4).（一）10分钟和20分钟处理之间没有明显的温差(*P>（P）*0.05,n个= 9).

图2
LIPUS保护视网膜轴突束不萎缩，RGC不丢失。**（A）**假手术组、假手术+LIPUS-7d组、ONC-7d组和ONC+LIPUS-7d组Tuj1-免疫阳性整体染色。比例尺=25μm。d日，远端；第页，近端区域。**（B）**量化轴突束和RGC的简单方法。Tuj1染色可识别视网膜轴突束和RGC。利用FIJI软件从免疫荧光图像中分离出高对比度图像。**（C）**Tuj1-标记RGC的量化(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*<0.01，n个＝24个字段）。**（D）**感兴趣区Tuj1阳性轴突束外径的定量（AOI）(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*<0.01，n个=24个字段）。**（E）**假手术7d、假手术+LIPUS-7d、ONC-7d和ONC+LIPUS-7d组的FG标记全视网膜。比例尺=500μm（放大，50μm）。**（F）**FG-阳性RGC的定量(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*<0.01，n个=24个字段）。

图3
通过OCT检查，LIPUS保护视网膜不致变薄。**（A）**小鼠ONC 7和14天视网膜OCT扫描结果。ONC0d、7d和14d的高倍图像是从距ON 500–1500μm的区域获得的。**（B）**LIPUS组ONC0d、7d和14d的OCT扫描结果。比例尺=200μm。**（C）**ON挤压和LIPUS处理后视网膜整体厚度的变化(^∗*P（P）*< 0.05,n个= 7).（D）从ONC 7/14d组和ONC 7/14 d+LIPUS组的#1、#2、#3和#4盒子中获得了具有代表性的高功率图像**图3A、B**视网膜识别层标记为RNFL/GCL/IPL、INL、OPL、ONL和OLM/RPE。特别是，对RNFL/GCL/IPL的厚度进行了量化。比例尺=100μm。**（E）**ONC组和ONC+LIPUS组第1、7和14天RNFL/GCL/IPL厚度的定量(^∗∗*P（P）*<0.01，^****P（P）*< 0.001,n个= 7). ON，视神经；ONC，视神经挤压；RNFL，视网膜神经纤维层；GCL，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层；OLM，外界膜；视网膜色素上皮。

图4
LIPUS在ONC模型中保护RGC免受凋亡。**（A）**假手术组、LIPUS组、挤压组和挤压+LIPUS的视网膜切片TUNEL染色结果（红色）。GCL显示TUNEL+细胞，SMI32免疫染色显示RGC轴突呈绿色。白盒高倍图像显示TUNEL和DAPI在GCL中的共定位。**（B）**凋亡细胞与DAPI的比率(*^∗P（P）*< 0.05,n个= 6).（C）TUNEL（红色）和Tuj1（绿色）的免疫共染色显示ON损伤后视网膜中的凋亡细胞。白盒高倍图像显示TUNEL和DAPI在GCL中的共定位。**（D）**凋亡细胞的定量与DAPI(*^∗P（P）*< 0.05,n个= 6).（E）Western blot检测挤压组和挤压+LIPUS组在ONC 1d、ONC 3d和ONC 7d的procaspase-3和cleaved-caspase-3的表达(*^∗P（P）*< 0.05,*^***P（P）*< 0.001,n个= 6).（F）Rot（0.5μg/ml）诱导初级RGC在体外损伤模型。TUNEL染色显示对照组、LIPUS、Rot和Rot+LIPUS组RGC凋亡。比例尺=25μm。**（G）**TUNEL阳性细胞与DAPI的定量，以凋亡指数（AI）表示(*^∗P（P）*< 0.05,n个= 6).（H）Western blot结果显示，在Rot组中有更多的切割型caspase-3表达。比例尺=100μm（放大，50μm）。^∗∗*P（P）*<0.01，^****P（P）*< 0.001,n个=6。

图5
LIPUS促进视网膜YAP核移位和p-YAP降低。**（A）**Western blot结果显示LIPUS强度依赖性YAP和p-YAP^第127节在1、2、5年级的表现(^∗∗*P（P）*<0.01，^****P（P）*< 0.001,n个= 4).（B）YAP和p-YAP的位置^第127节IF染色在视网膜中。LIPUS组RGC、INL和ONL中出现较多YAP阳性细胞。白盒显示YAP和p-YAP的相对位置的高功率图像。比例尺=100μm。盒内标尺=5μm。**（C）**YAP和p-YAP的量化^第127节-视网膜阳性区域与DAPI(^∗∗*P（P）*<0.01，^****P（P）*< 0.001,n个= 4).（D）YAP和p-YAP的高功率细胞和核定位^第127节他们的线保护文件是由FIJI软件生成的。OD值in年-axis显示相对强度超过基线。比例尺=5μm。**（E）**用DAPI定量YAP/p-YAP共定位指数。^****P（P）*< 0.001,n个=6。

图6
LIPUS促进YAP核转位和p-YAP^第127节RGC减少。**（A）**对照组和LIPUS治疗组Tuj1-阳性RGC中的YAP定位。**（B）**p-YAP（对-YAP）^第127节对照组和LIPUS治疗组中Tuj1-阳性RGC。黄色虚线框显示YAP和p-YAP相对位置的高倍图像。**（C）**对照组和LIPUS治疗组RGC YAP表达的Western blot结果。OD的定量显示对照组和LIPUS组之间存在显著差异。**（D）**p-YAP的Western blot结果^第127节对照组和LIPUS治疗组RGC的表达。OD的量化在对照组和LIPUS组之间显示出显著差异。^∗*P（P）*< 0.05,n个= 6. 比例尺=5μm。

图7
LIPUS通过YAP-caspase-3信号通路保护RGC免受凋亡。**（A）**解剖ONC7d视网膜，Western blot检测sham、crush和crush+LIPUS组中YAP、p-YAP、caspase-3/裂解caspase-3的表达水平(^∗*P（P）*< 0.05,^****P（P）*< 0.001).（B）Western blot检测到对照组、LIPUS、Rot（0.5μg/ml）和Rot+LIPUS组原发性RGC中YAP、p-YAP、Bcl-2和Bax的表达水平(^****P（P）*< 0.001,n个= 4).（C）RGC中LIPUS依赖性YAP抑制中不同浓度的siYAP（0、25、50、100和200 pM）以及cyclin E1表达。GAPDH作为内部参考(^∗*P（P）*< 0.05,^∗∗*P（P）*<0.01，^****P（P）*< 0.001,n个= 4).（D）siYAP（100 pM）抑制Tuj1-阳性（绿色）RGC中LIPUS-依赖性YAP（红色）的表达。比例尺=25μm。**（E）**siYAP、LIPUS和siYAP+LIPUS组YAP阳性信号的曲线图。提出了大功率YAP-正信号场，该信号源于D类曲线显示了黄色试验品系单个RGC原点YAP信号的光学OD值，其中LIPUS组的YAP水平高于其他两组(^∗∗*P（P）*<0.01，n个=6，比例尺=5μm）。**（F）**Western blot结果显示，LIPUS刺激与siYAP和Rot在RGC中结合。在YAP抑制和Rot诱导的神经退行性变条件下检测到裂解的caspase-3/procaspase-3级联信号(^∗*P（P）*< 0.05,^****P（P）*< 0.001,n个= 4).（G）为了确认蛋白质印迹结果F类TUNEL染色检测不同LIPUS刺激和siYAP抑制下RGC的凋亡。Rot组发现更多凋亡细胞，但LIPUS部分挽救了Rot诱导的RGC神经变性(^∗∗*P（P）*<0.01，n个=6，比例尺=50μm）。

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