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.2018年7月25日；38(30):6722-6736.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0324-18.2018。 Epub 2018年6月26日。

预处理单核细胞对缺血性脑损伤的内源性保护作用

利迪娅·加西亚-波尼拉 1, 大卫·布雷 1, 科琳·贝纳基斯 1, 黛安娜A巷 1, 米歇尔墨菲 1, 杰米·摩尔 1, 吉安弗兰科·拉奇米 1, Xinran Jiang（新疆） 1, 科斯坦蒂诺·伊德科拉 1, 约瑟夫·安克雷特 2
附属公司

预处理单核细胞对缺血性脑损伤的内源性保护作用

莉迪亚·加西亚·博尼利亚等。 神经科学. .

摘要

脑缺血前暴露于低剂量脂多糖（LPS）对中风模型具有神经保护作用，这一现象称为预适应（PC）。虽然LPS-PC可诱导中枢和外周免疫反应，但调节缺血性损伤的细胞机制尚不清楚。在这里，我们研究了免疫细胞在PC提供的大脑保护中的作用，并测试了单核细胞是否可以通过体外LPS暴露，从而调节雄性小鼠脑缺血后的炎症损伤。我们发现全身注射低剂量LPS可诱导Ly6C你好在小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）后保护大脑的单核细胞反应。值得注意的是，在短暂MCAO后7小时，将预处理小鼠分离的单核细胞过继性转移到幼稚小鼠中可以减少脑损伤。基因表达和功能研究表明，单核细胞中的IL-10、诱导型一氧化氮合酶和CCR2对神经保护至关重要。即使暴露于小鼠或人类单核细胞，也能激发这种保护活性体外注射LPS，然后在中风后注射到雄性小鼠体内。细胞追踪研究表明，保护性单核细胞从脾脏动员，到达大脑和脑膜，在那里它们抑制缺血后炎症和中性粒细胞流入脑实质。我们的发现揭示了一个以前未被认识的脾单核细胞亚群，该亚群能够通过延长治疗窗口保护大脑，并为基于在缺血性卒中患者中输送自体或异体保护性单核细胞的细胞治疗提供了理论基础。重要性声明炎症是中风脑病理生理学的关键组成部分，是导致死亡和残疾的主要原因，治疗选择有限。在这里，我们研究了脑缺血保护的内源性机制。使用脂多糖（LPS）预处理（PC）作为诱导小鼠缺血耐受的一种方法，我们发现脾脏内产生神经保护性单核细胞，这些单核细胞从脾脏运输至大脑和脑膜，抑制缺血后炎症。重要的是，系统性LPS-PC可以通过过继转移在体外-中风后平移相关时间点预处理的小鼠或人类单核细胞。这种神经保护模型可能有助于临床努力提高骨髓单个核细胞治疗急性神经疾病（如脑缺血）的疗效。

关键词：收养转移；脑缺血；脂多糖；单核细胞；神经保护。

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数字

图1。
图1。
系统性LPS-PC诱导炎性单核细胞选择性向大脑和脑膜募集。A类基于CD45和Ly6C表达对分离的P1、P2、P3和P4人群脑细胞进行流式细胞术分析。P1确定的浸润性脑白细胞（CD45你好)注射LPS后24小时（0.5 mg/kg，i.p.）；P2对应于小胶质细胞（CD45整数赖氨酸6C−); P3识别的内皮细胞（CD45−赖氨酸6C+); 和P4对应于CD45−赖氨酸6C−细胞。进一步分析浸润白细胞（P1）上CD115和Ly6G的表达，确定招募的单核细胞（CD45）你好CD115型+赖氨酸6G−)中性粒细胞（CD45你好CD115型−赖氨酸6G+). 与盐水注射小鼠相比，LPS处理小鼠的浸润MMös增加。B类，LPS处理小鼠与盐水注射小鼠外周血（PB）或脾脏（SP）中白细胞数量的热图分析。计算治疗后24、48、72或96小时每个组织的白细胞数量频率。日志2计算每个终点LPS在生理盐水中的折叠变化。统计分析：未配对双尾学生t吨测试*第页< 0.05; #第页< 0.01; §第页< 0.001.C类、CD115的代表性图像+Lx（磅）+大脑中的细胞。上图显示Lx+单核细胞（绿色），TGF-β（红色）染色，与GLUT1阳性（蓝色）内皮细胞密切相关。下图显示Lx+（绿色）和Iba1-中间（红色）单核细胞，靠近具有星状形态的Iba1-高小胶质细胞。D类，CD115+大脑中的细胞定量显示，在注射LPS后的前72小时内，LPS处理小鼠的MMös持续增加。Ly6G的瞬时增加+注射LPS的小鼠在24小时时观察到细胞数量，尽管在最初72小时内，盐水和LPS治疗之间的脑中性粒细胞没有发现统计变化(n个=5-14只小鼠/组）。统计分析：双向方差分析（交互作用，F类(2,44)= 0.07020,第页= 0.9323; 时间，F类(2,44)= 0.4909,第页= 0.6154; 治疗，F类(1,44)= 55.76,第页<0.0001），然后是Sidak事后（post-hoc）测试**第页< 0.05; ****第页< 0.000.E类，左侧，量化大脑CD115的总细胞数+赖氨酸6C你好（深色）和CD115+赖氨酸6C洛治疗24小时后，盐水或LPS处理的小鼠（浅色）。CD115的百分比+赖氨酸6C你好占总CD115+括号中给出。右，血液炎性单核细胞百分比（CD115+赖氨酸6C你好)在生理盐水或LPS治疗小鼠24小时后(n个=12–13只小鼠/组）。增加Ly6C你好在LPS处理小鼠的大脑中观察到MMös的数量。统计分析：双向方差分析（交互作用，F类(1,46)= 31.16,第页<0.0001；治疗，F类(1,46)= 69.33,第页<0.0001；亚群，F类(1,46)= 37.92,第页<0.0001），其次是Sidak氏事后（post-hoc）测试***第页<0.0001；NS，无统计学意义。F类，总计MMö（CD115+)和炎症MMö（CD115+赖氨酸6C你好)盐水浸泡24小时后，小鼠脑膜的数量增加(n个=8）或LPS(n个=7）注射。中性粒细胞（Ly6G+)没有改变。统计分析：未配对双尾学生t吨测试(t吨=16.93，df=13****第页<0.0001）对于总CD115+细胞；未配对双尾学生的t吨测试(t吨=7.207 df=1****第页<0.0001）对于CD115+赖氨酸6C你好细胞。
图2。
图2。
过继转移从预处理供体分离的LPS引物单核细胞可降低中风受体小鼠的梗死体积。A类，中风小鼠单核细胞过继转移的实验设计。小鼠注射LPS或生理盐水，24小时后通过免疫耗竭从BM中分离单核细胞。盐或LPS单核细胞（5×105单核细胞/100μl）在短暂性MCAO前24小时或MCAO后7或24小时静脉注射到中风小鼠体内。MCAO后72小时通过甲酚紫染色测定梗塞体积。B类在开始免疫去除之前和纯化免疫去除之后，对分离的BM细胞进行CD11b、CD115、Ly6G、CD117和Ly6C标记物染色。流式细胞术检测染色细胞。从CD11b、CD115和Ly6C标记物的表达以及中性粒细胞标记物Ly6G和造血干细胞标记物CD117的缺乏可以证明单核细胞的高纯度分离。C类在MCAO前24小时（−24小时）或MCAO后7或24小时（分别为+7小时和+24小时），盐水注射小鼠（SAL）、LPS预处理小鼠（LPS）或接受LPS预条件小鼠分离的单核细胞的小鼠脑梗塞的代表性图像。接受盐水注射小鼠单核细胞的小鼠显示为SAL+7小时，接受LPS注射小鼠分离的中性粒细胞的小鼠表示为PMN+7小时。MCAO后72小时，甲酚紫染色的脑冠状切片勾勒出梗死（苍白区域）轮廓。AT，收养转移。D类，LPS预处理小鼠（LPS i.p.）或接受过继转移LPS单核细胞+7小时的小鼠的梗死体积明显较小(n个= 9–12). 统计分析：Kruskal–Wallis（H=15.65，第页=0.0035），然后是邓恩事后（post-hoc）测试*第页< 0.05; ***第页< 0.001.E类MCAO后+7小时通过转移从盐水注射小鼠分离的单核细胞或LPS预处理小鼠的中性粒细胞（PMN）并不能减少梗死体积(n个= 8–11). 统计分析：单因素方差分析F类(3,32)= 7.747,第页=0.0006，其次为Holm–Sidak’s事后（post-hoc）测试*第页< 0.05.
图3。
图3。
LPS预处理小鼠脑相关单核细胞的转录组分析。A类，日志2折叠式变化与第页-LPS预处理小鼠与盐处理小鼠分离脑MMös基因表达的微阵列数据分析值图(n个= 2–3,n个=8–12），突出显示下调基因（蓝色，<4倍）和上调基因（红色，>4倍）。B类基因表达的基因本体（GO）分析揭示了与免疫和炎症反应相关的基因上调、GTPase活性调节、胆固醇稳态和细胞粘附、细胞增殖、正转录调节和血管生成途径成员基因下调。C类热图显示LPS和盐水（SAL）处理小鼠中前20个基因上调，前20个下调。D类，通过qRT-PCR定量小鼠BM单核细胞中Arg1、IL-10和iNOS基因（Nos2）的表达。注射LPS或SAL 24小时后分离单核细胞。数据表示为相对值n个-SAL组的折叠变化。LPS诱导的单核细胞中Arg1、IL-10和Nos2 mRNA显著上调。统计分析：Arg1、Mann-Whitney检验(U型= 0, ****第页< 0.0001); IL-10，Mann-Whitney试验(U型＝0时****第页< 0.0001); 2号，未配对双尾学生t吨测试(t吨=2.895，df=13*第页= 0.0125).E类通过测定尿素定量精氨酸酶活性，通过ELISA测定IL-10蛋白水平，通过Griess反应定量iNOS活性，结果表明LPS预处理小鼠BM单核细胞的活性或蛋白水平高于盐水处理小鼠的BM单细胞。统计分析：尿素，Mann-Whitney试验(U型= 0, **第页< 0.0012); IL-10，非配对双尾学生t吨测试(t吨=6.749，df=10****第页< 0.0001); 否，非配对双尾学生t吨测试(t吨=4.83，df=8**第页=0.0013）。F类，与交替激活的巨噬细胞极化相关的基因的定量显示，LPS处理后24小时分离的BM单核细胞中的mRNA水平高于盐水处理。统计分析：Retnla，非配对双尾学生t吨测试(t吨=4.371，df=9**第页= 0.0018); Chi3l3，非配对双尾学生t吨测试(t吨=13.71，df=9****第页<0.0001），Stab1，非配对双尾学生t吨测试(t吨=5.426，df=9***第页= 0.0004).
图4。
图4。
IL-10、iNOS和CCR2是LPS激发的单核细胞诱导的神经保护所必需的。A类，量化精氨酸1,白介素-10、iNOS(2个),雷特纳,Chi3l3公司、和刺1通过qRT-PCR在培养BMM、经典或替代激活BMM（分别为CAM和AAM）和MDSC中的基因表达。统计分析：克鲁斯卡尔·沃利斯（Kruskal–Wallis）、邓恩（Dunn）检验和BMM；参数1（H=8.291，第页= 0.0013), *第页= 0.05;白介素-10（H=10.97，第页<0.0001）**第页= 0.01;2个（H=9.859，第页= 0.003), *第页= 0.05;雷特纳（H=9.929，第页= 0.0012), *第页= 0.05;Chi3l3公司（H=10.24，第页= 0.006), *第页= 0.05;刺1（H=7.750*第页= 0.0286), *第页=0.05；n个=3–4/组。B类，脾CD4细胞数量增加+在MDSC存在的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体刺激细胞。CD4的百分比+计算T细胞增殖以评估抑制功能(n个= 2).x个-轴值代表MDSC/脾CD4+细胞比例。C类通过流式细胞术对非髓系白细胞、生理盐水（SAL）或LPS处理小鼠的BM单核细胞、培养的BMM和经典或替代激活的BMM（分别为CAM和AAM）进行CCR2信号中值荧光定量分析。统计分析：单因素方差分析F类(5,13)= 26.13,第页<0.0001），然后是Holm–Sidak事后（post-hoc）测试**第页< 0.01; ****第页< 0.0001;n个=3–4/组。D类接受BMM（MCAO后+7小时）、接受经典（CAM）或替代（AAM）激活的BMM或极化为MDSC的BMM的小鼠梗死体积与接受盐水（SAL）治疗的小鼠没有差异(n个=4–10只小鼠/组）。统计分析：Kruskal–Wallis（H=2.833，第页= 0.7257).E类，小鼠接受从IL-10分离的单核细胞（MCAO后7小时）−/−、iNOS−/−或CCR2−/−LPS预处理小鼠，但不来自COX2−/−与接受WT-LPS-预处理小鼠分离的单核细胞的小鼠相比，LPS预处理小鼠的梗死面积更大(n个=6-8只小鼠/组）。AT，收养转移。统计分析：单因素方差分析(F类(3,32)= 4.175,第页=0.0040），然后是Holm–Sidak事后（post-hoc）测试*第页< 0.05.
图5。
图5。
LPS诱导脾单核细胞向脑和脑膜的转运。A类、Lx定位代表图+脾内注射（1.8×10）后24小时脾内9颗粒）。珠粒（绿色）聚集在MZ和包膜下的红色果肉中。用TO-PRO-3（红色）荧光核染色显示脾脏的结构解剖（横切面）。B类,C类，代表性流式细胞术直方图(B类)和量化(C类)MMós（CD115+单元格）显示含有Lx的MMös的百分比+LPS-PC或盐水注射小鼠24小时后脾脏、血液、大脑和脑膜中(n个=3–4/组）。Lx总数+CD115型+括号中给出了大脑和脑膜中的细胞。Lx（磅）+在生理盐水或脂多糖治疗后7小时注射到脾脏。统计分析：未配对双尾学生t吨测试，血液(t吨=2.77，df=6*第页=0.0321），大脑(t吨=7.81，df=6***第页=0.0002）和脑膜(t吨=5.22，df=6**第页= 0.0019).D类，接受24小时MCAO并接受GFP的小鼠脾脏（左）和脑膜（右）的代表性图像+单核细胞（5×105MCAO后7小时从LPS预处理小鼠分离的细胞。脾脏横切面用DAPI（红色）染色进行核染色。过继性转移积聚在脾脏红髓中的单核细胞。在脑膜中，IV型胶原（红色）免疫组织化学显示单核细胞与脑膜血管相关。E类MCAO后24小时WT小鼠脑膜过继转移单核细胞（AT）的定量。小鼠接受GFP+中央控制室2+/+单核细胞（CCR2+/GFP公司)或RFP+中央控制室2−/−单核细胞（CCR2招标书/招标书; 5 × 105从GFP-WT或CCR2分离的细胞招标书/招标书LPS预处理小鼠。GFP或RFP荧光用于追踪转移的BM单核细胞(n个=4只小鼠/组）。CCR2基因缺失导致脑膜相关单核细胞减少。统计分析：未配对双尾学生t吨血液测试(t吨=2.96，df=5*第页= 0.0315).F类MCAO前24小时接受生理盐水或脂多糖治疗（i.p.）的假手术（sham）或脾切除术（Splenetectomy）小鼠的梗死体积分析。用LPS治疗的假手术小鼠表现出梗死体积减少，而用生理盐水（SAL）或LPS处理的脾切除术小鼠之间没有观察到统计学意义(n个=6–10只小鼠/组）。统计分析：单因素方差分析(F类（3,29）= 5.608,第页=0.0037），然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试**第页< 0.05.G公司，接受以下治疗的非手术（sham）或脾切除（脾切除术）小鼠的梗死体积分析体外MCAO后7小时LPS激发的单核细胞（LPS exmono）。假手术小鼠的梗死面积明显小于脾切除术小鼠(n个=9–11只小鼠/组）。统计分析：Mann-Whitney检验(U型= 0.03 *第页< 0.05).
图6。
图6。
MCAO后，LPS-PC增加脑膜单核细胞/巨噬细胞，减少脑中性粒细胞募集。脑膜免疫细胞浸润的流式细胞术分析(A类)和大脑(B类)MCAO后48小时盐水或LPS预处理小鼠(n个=8只小鼠/组）。流式细胞术图描述了门控策略。浸润白细胞（CD45你好)通过CD11b和CD115的高表达和CD11c和Ly6G（CD115+单元格）。通过高Ly6C表达（CD115）将炎症性MMö亚类化+赖氨酸6C你好). 通过CD11b和Ly6G的高表达和CD11c和CD115（Ly6G）的低表达来鉴定中性粒细胞（PMN）+单元格）。A类，图表显示炎症MMö增加（CD115+和CD115+赖氨酸6C你好MCAO后LPS预处理小鼠脑膜中的细胞）。统计分析：CD115+，未配对双尾学生t吨测试，血液(t吨=2.381，df=13*第页= 0.0332); CD115型+赖氨酸6C你好，未配对的双尾学生t吨测试，血液(t吨=2.186，df=13*第页= 0.0477);B类图表显示MCAO后LPS预处理小鼠的脑中性粒细胞（PMN）减少。统计分析：Ly6G+，未配对双尾学生t吨血液测试(t吨=2.502，df=13*第页= 0.0265).
图7。
图7。
收养转让体外LPS预处理小鼠和人单核细胞对MCAO后受体小鼠起保护作用。A类，过继性接受治疗的小鼠梗死体积分析体外PBS处理的单核细胞（PBS exmono）、LPS处理的（LPS；100 ng/ml，2 h）单核细胞，或MCAO后7 h裂解的LPS处理单核细胞。老鼠接收体外LPS激发的单核细胞显示梗死体积减少(n个=7–8只小鼠/组）。统计分析：单因素方差分析F类(2,19)= 4.933,第页=0.0188），其次是Bonferroni氏事后（post-hoc）测试*第页< 0.05.B类，通过磁带测试性能评估感觉运动功能表明，小鼠接受体外与接受PBS处理的单核细胞的小鼠相比，在MCAO后第3天，LPS处理的小鼠接触受损爪子（对侧）胶带的潜伏期缩短(n个=13只小鼠/组）。统计分析：双向方差分析（交互作用，F类(1,49)= 7.828,第页= 0.0073; 治疗，F类(1,49)= 5.915,第页= 0.0187; 时间，F类(1,49)= 18.4,第页<0.0001），然后是Sidak事后（post-hoc）测试**第页< 0.01.C类，量化白介素-10和2个（iNOS）的qRT-PCR表达体外PBS或LPS处理的单核细胞在LPS处理后2小时显示两个基因上调(n个=4/组）。统计分析：未配对双尾学生t吨测试，白介素-10(t吨=15.19，df=6****第页<0.0001）和2个(t吨＝16、df=5****第页< 0.0001).D类，中风小鼠的梗死体积分析体外MCAO后7小时，PBS或LPS处理人单核细胞。与接受PBS刺激的人单核细胞的小鼠相比，LPS刺激的人类单核细胞显著减少MCAO后的梗死体积(n个=9–10只小鼠/组）。统计分析：未配对双尾学生t吨测试(t吨=2.267，df=17*第页= 0.0367).E类、GFP过继移植后脑膜的组织学+单核细胞体外用脂多糖处理。MCAO后7小时转移的单核细胞被招募到脑膜，在那里它们与血管相关（血管外和血管内定位），通过IV型胶原的表达确定。该图显示了接受PBS或LPS的小鼠在MCAO 48小时脑膜中累积的过继转移单核细胞（AT）数量体外-处理过的GFP+单核细胞。各组间累积单核细胞数量无差异(n个=4只小鼠/组）。统计分析：未配对双尾Student’st吨测试(t吨=0.5148，df=6，第页= 0.6251).F类，小鼠脑膜中炎症分子的基因表达体外MCAO后48小时PBS-或LPS-激发的单核细胞。降低Cxcl5公司,Csf2型,立方英尺、和Cxcl10公司在接受LPS引物的单核细胞的小鼠脑膜中观察到基因上调(n个=10–11只小鼠/组）。统计分析：未配对双尾学生t吨测试，Cxcl5公司(t吨=3.6298，df=7*第页= 0.0084);Csf2型(t吨=4.4886，df=7*第页= 0.0028);立方英尺(t吨=2.6324，df=7*第页=0.0337），以及Cxcl10公司(t吨=2.7547，df=7*第页= 0.0283).
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