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.2018年7月：67:15-23。
doi:10.1016/j.placenta.2018.05.008。 Epub 2018年5月17日。

氧化应激诱导母胎界面细胞p38MAPK依赖性衰老

金进 1, 劳伦·理查森 2, 萨曼莎·雪勒·米勒 三, 钟南伯特（Nanbert Zhong） 4, 拉姆库马尔·梅农 5
附属公司

氧化应激诱导母胎界面细胞p38MAPK依赖性衰老

金进等。 胎盘. 2018年7月.

摘要

目标：本研究检测了氧化应激（OS）诱导胎-母界面细胞衰老途径的机制。

方法：将正常足月（非分娩）妇女胎盘膜上分离出的原代羊膜间充质细胞（AMC）、绒毛膜细胞和蜕膜细胞暴露于OS诱导的香烟烟雾提取物（CSE）中48 h。使用2’7’-二氯二氢荧光素测量活性氧物种（ROS）。Western blot分析检测磷酸化（P）p38MAPK和p53的表达。分别用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）和基质金属肽酶9（MMP9）组织化学方法检测衰老和炎症。用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或p38MAPK抑制剂SB203580（SB）共同处理细胞，验证了激活特异性。

结果：与对照组相比，CSE增加了AMC、绒毛膜细胞和蜕膜细胞的ROS生成（P<0.05）。Western blot分析表明，CSE诱导p38MAPK活化（P<0.05），NAC共处理抑制所有细胞类型的ROS生成和p38MAPK活化（P<0.01）。CSE没有增加任何细胞中的p53磷酸化；然而，AMC表现出结构性的P-p53表达。与对照组相比，CSE增加了AMC和绒毛细胞的衰老（分别为P=0.01和P=0.003）；但蜕膜细胞未见衰老。SB和NAC联合治疗后，衰老显著减少（AMCs；P=0.01和绒毛膜；P=0.009）。CSE增加了NAC减少的所有细胞中的MMP9。

结论：OS在所有与胎儿细胞衰老相关的细胞类型中诱导p38MAPK激活和炎症，但在母体细胞中没有。

关键词：羊膜间充质细胞；合唱团；Decidua；氧化应激；衰老；第38页地图。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。胎盘膜细胞的特征
明亮视野和荧光显微镜显示培养的原代羊膜间充质细胞（AMC）、绒毛膜细胞和蜕膜细胞的形态。荧光显微镜显示体外AMC、绒毛膜细胞和蜕膜细胞中的波形蛋白（绿色）和细胞角蛋白-18（CK-18；红色）定位。图像是在10倍放大的条件下拍摄的。
图2
图2。胎儿膜细胞中活性氧的产生
A）香烟烟雾提取物（CSE）处理羊膜间充质细胞（AMCs）10分钟后显著增加ROS的产生(P（P）<0.05）和20分钟(P（P）<0.05）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）和CSE共同处理显著降低AMC的ROS生成(P（P）所有时间点均<0.05）。B）CSE处理绒毛膜细胞显著增加ROS生成(P（P）<0.001）与对照绒毛膜细胞相比。NAC和CSE共同处理显著阻止绒毛膜细胞产生ROS(P（P）所有时间点均<0.05）。C）CSE处理蜕膜细胞显著增加ROS生成(P（P）<0.001）。NAC和CSE共同处理显著降低蜕膜细胞的ROS生成(P（P）<0.001）。蓝线上方的星号表示对照组和CSE处理的细胞之间存在显著差异，而最后一行下方的星号则表示CSE和CSE以及NAC共同处理的细胞间存在显著差异。
图3
图3。香烟烟雾提取物（CSE）诱导胎盘膜细胞p38MAPK活化
A–F）CSE处理羊膜间充质细胞（AMCs）、绒毛膜细胞和蜕膜细胞长达6小时，诱导p38MAPK磷酸化（P），如western blots和免疫荧光测定。A）CSE处理诱导AMC中P-p38MAPK水平高于对照细胞(P（P）=0.0005），而CSE+N-乙酰半胱氨酸（NAC）降低了P-p38MAPK水平(P（P）= 0.005). 治疗并未改变p38MAPK的总水平。B）CSE处理后P-p38MAPK的核转位增加，但被p38MAPK抑制剂SB203580（SB）抑制。C）CSE处理诱导绒毛细胞中P-p38MAPK水平高于对照细胞(P（P）=0.009），而CSE+NAC降低了P-p38MAPK水平(P（P）= 0.006). 治疗并未改变p38MAPK的总水平。D）CSE处理后，P-p38MAPK在绒毛膜细胞中的核定位增加，而CSE+SB处理阻止了这种移位。E）与对照组相比，CSE处理诱导蜕膜细胞中P-p38MAPK水平升高(P（P）<0.0001），而CSE+NAC联合治疗降低了P-p38MAPK的激活(P（P）< 0.0001). 治疗并未改变p38MAPK的总水平。F）蜕膜细胞中P-p38MAPK的核定位与AMC相似。CSE使相对荧光增强，而CSE+SB处理降低了易位。条形图表示密度测定，y轴表示相对密度测定单位。共聚焦显微镜图像以63倍放大率拍摄。红色染色表示α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），绿色染色表示P-p38MAPK，蓝色表示DAPI核染色。
图4
图4。香烟烟雾提取物（CSE）不会诱导AMC中的p53激活
无论何种治疗，羊膜间充质细胞（AMCs）组成性表达P-p53和总p53。免疫荧光染色记录了CSE治疗后P-p53的核定位（白色箭头）。共聚焦显微镜图像是在放大63倍的条件下拍摄的。红色染色代表α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），绿色染色代表P-p53，蓝色染色代表DAPI核染色。
图5
图5。香烟烟雾提取物（CSE）诱导胎盘膜细胞衰老
A）香烟烟雾提取物（CSE）处理（48小时）在羊膜间充质细胞（AMC）和绒毛膜细胞中诱导衰老相关-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色（蓝色染色；红色箭头），但对蜕膜细胞几乎没有影响。B）CSE治疗显著诱导SA-β-Gal(P（P）=0.02），而CSE+N-乙酰半胱氨酸（NAC）显著降低SA-β-Gal染色(P（P）= 0.01).C）CSE治疗显著诱导SA-β-Gal(P（P）=0.003），而CSE+NAC显著抑制SA-β-Gal染色(P（P）=0.009）。D）CSE处理的蜕膜细胞与对照蜕膜细胞之间或与NAC共处理后，SA-β-Gal染色无显著差异。治疗48小时后，在放大20倍的条件下拍摄所有的亮场图像。数据以相对强度单位（RIU）记录。
图6
图6。香烟烟雾提取物（CSE）诱导胎盘膜细胞衰老相关炎症
A）培养48小时的足月非产时（TNIL）外植体（对照组）在任何胎盘膜层（即羊膜上皮细胞（AECs）、羊膜间充质细胞（AMCs），绒毛膜细胞或蜕膜细胞）均不表达MMP9。B）CSE处理TNIL外植体48小时可诱导所有细胞层中MMP9的表达。C）CSE+NAC联合治疗降低了MMP9的表达。
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