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.2018年6月20日；16（6）：e2004049。
doi:10.1371/journal.pbio.2004049。 eCollection 2018年6月。

报告者在培养和体内标记和消除基底或管腔上皮细胞

奥尔莫·桑佐尼 1 2, 詹妮弗·海恩斯 三, 劳丽·A·赛弗里德 三, 亚希亚·卡梅尔 三, 黄凯（Kai Huang） 三, 迈克尔·D·贝戈拉 三, 费斯·欧阳 三, 塞琳·罗伯特·蒂索特 4, 玉晶J Heng 5, 鑫源 1 5, Gerbug M Wulf公司 1 2, 肯·J·克伦 三, 艾文·瓦根布拉斯 6, 马修·卢皮恩 三, 托马斯·基斯林格 三, 格雷戈里·汉农 6 7, Senthil K Muthuswamy公司 1 2 5
附属公司

在培养和体内标记和消除基底或管腔上皮细胞的报告者

奥尔莫·桑佐尼等。 公共科学图书馆生物. .

摘要

基底细胞和管腔细胞对癌症进展和转移的作用尚不清楚。我们报道了由角蛋白-14（K14）或角蛋白-8（K8）启动子驱动的报告系统的生成，该系统不仅表达荧光蛋白，还表达诱导自杀基因。转基因小鼠将报告基因表达在乳腺上皮的右侧细胞室中，并对毒素治疗产生反应。此外，我们将报告人构建到4T1转移性小鼠肿瘤细胞系中，并证明K14+细胞，而不是K14-或K8+细胞，在三维（3D）培养中具有高度侵袭性，并且在体内具有转移性。用报告靶向毒素治疗培养细胞或小鼠肿瘤可抑制体内侵袭行为和转移。对K14+和K14-细胞的RNA测序（RNA-seq）、分泌组和表观基因组分析确定了两性激素诱导蛋白2（Amigo2）是一种新的细胞侵袭驱动因子，其表达与TP53野生型（WT）乳腺癌患者无复发生存率降低相关。

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数字

图1
图1。K14.GFP报告子的特征以及K14+和K14−状态与培养细胞侵袭行为的关系。
（A） K14启动子驱动的EGFP-P2A-DTR（K14.GFP）报告子构建的卡通。（B） IF显示内源性K14和GFP在K14中的共定位。GFP+单层，标尺20μm。（C） 通过FACS对稳定转染的K14.GFP报告细胞进行分类，并通过流式细胞术监测54天内表达GFP的细胞百分比的变化。（D） K14.GFP+和K14.GFP-和WT细胞在100μm比例尺下二维生长的相位对比图。（E） 单元格数量随时间变化。图表显示了3个独立实验的平均值±SEM。（F） EdU标记和流式细胞术鉴定细胞周期不同阶段的细胞。所示为三倍的平均值±SD。（G） K14.GFP+和K14.GFP-和WT细胞在m/Col-I顶部的3D（比例尺200μm）中生长4天。接种两天后，用DT（5 ng/ml）处理细胞48小时（下面板，DT+）。（H） G中侵入性结构的量化，所示数据为三次独立实验的平均值±SD，至少统计了300个结构/条件*第页<0.05（未配对）t吨测试。（一） 第2天和第4天在M/Col-I中生长的K14.GFP+细胞的相位对比和GFP叠加图像。黑色箭头表示侵入性突起处的GFP+细胞，白色箭头表示非侵入性3D结构中的GFP+。DT+表示48小时接触DT，比例尺为100μm。3D、三维；DT，白喉毒素；DTR，白喉毒素受体；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2´-脱氧尿苷；增强型绿色荧光蛋白EGFP；荧光激活细胞分选；绿色荧光蛋白；IF，免疫荧光；K、 细胞角蛋白；M/Col-I，基质/胶原蛋白-I的1:1混合物；pA，聚腺苷酸化信号序列；WT，野生型
图2
图2。K14.GFP+细胞比K14.GFP−细胞具有更大的转移潜力体内.
（A） 在实验过程中测量注射4T1对照或K14.GFP报告细胞系（K14.GFP+或K14.GFP-）的小鼠的原发肿瘤直径。n个=8（对照组）、7（K14.GFP+）和8（K14.GFP-）*第页< 0.05, **第页通过单因素方差分析（ANOVA）和Newman-Keuls多重比较后测得出<0.001。（B） 小鼠安乐死后测量最终肿瘤质量。（C） 通过测量肿瘤在5个截面（5μm厚）中以200μm间隔切割的平均肺组织面积百分比来量化肺转移。（D） 含有K14.GFP+或K14.GFP-细胞系注射小鼠转移瘤的H&E染色肺切片的代表性图像。箭头表示转移；1 mm比例尺。（E）原发肿瘤肿块与肺转移的相关性分析。分析的每只小鼠肺组织肿瘤面积百分比与原发肿瘤质量的散点图(n个= 23). 通过线性回归分析，斜率与零没有显著差异(第页= 0.1097). K14.GFP+和K14.GFP-细胞肿瘤中Ki67（F）和CC3（G）阳性细胞百分比的定量。所示为整个肿瘤切片定量的平均值±SD。（H） 小鼠安乐死后测量最终肿瘤质量。对于DT治疗，小鼠在第7、9、11和13天通过腹腔注射DT（25 mg/kg）。n个=7（K14.GFP+；无DT）、4（K14.GFP+；有DT），8（K14.GWP-；无DT）和4（K14.GFP-；有DT.）。第页=0.0425（未配对）t吨测试。（一） 对H中描述的小鼠肺转移进行量化。通过单向方差分析计算（B）、（C）和（I）的统计分析，然后进行Tukey多重比较后验*第页<0.05或n.s.（J）对K14产生的原发性肿瘤进行K14和GFP的荧光IHC。如（H）所述，经DT−或DT处理的GFP+细胞系（“DT+”）；比例尺40μm。（K） 在K14.GFP+注射小鼠的转移性肺上进行与J中所述相同的染色；标尺20μm。（五十） 对原发性肿瘤裂解物的免疫印迹进行GFP表达分析。每条车道都代表着不同的肿瘤。用ERK1/2抗体检测斑点，作为负荷控制。如果没有其他说明，所有图表均显示平均值±SEM.DT，白喉毒素；ERK1/2，细胞外信号调节激酶1/2；绿色荧光蛋白；H&E、苏木精和曙红；IHC、免疫组织化学；腹腔注射；K、 细胞角蛋白；不另作说明，不重要
图3
图3。表达K14和K8报告基因的4T1细胞系的产生和鉴定。
（A） K14启动子的卡通——驱动tRFP-P2A-TK（K14.tRPT）报告基因的表达。（B） K8启动子的卡通——驱动tGFP-P2A-DTR（K8.tGPD）报告子结构的表达。（C） 在m/Col-I培养基上生长4天的单层（上面板，标尺100μm）和3D（下面板，标杆200μm）中K14+、K14−和K8+细胞的相位对比图。（D） C中侵入性结构的量化，表示为来自3个独立实验的平均值±SEM*第页<0.001（未配对）t吨测试。（E） 用DT（2.5 ng/ml）、GCV（1μg/ml）或培养基处理K14+和K8+细胞。柱条表示流式细胞仪测定的所示细胞系处理后报告阳性和阴性细胞的百分比。（F） 对K14+和K14−报告细胞系裂解产物的免疫印迹进行分析，以了解E-cadherin、β-catenin、纤维连接蛋白、波形蛋白和α-SMA的表达变化。用GAPDH抗体和α-微管蛋白抗体检测印迹，作为负荷对照。右侧面板显示3个独立的western blot的波形蛋白定量第页=0.0317（成对）t吨测试；显示平均值±SD。（G） K14+（上面板）和K14−（下面板）单层的波形蛋白、β-catenin免疫荧光或内源性tRFP信号检测。比例尺25μm。α-平滑肌肌动蛋白；DT，白喉毒素；DTR，白喉毒素受体；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；GCV，更昔洛韦；K、 细胞角蛋白；K8.tGPD、角蛋白-8启动子、涡轮绿色荧光蛋白和白喉毒素受体；K14.tRPT、角蛋白-14启动子、涡轮红荧光蛋白和单纯疱疹病毒胸苷激酶；M/第I列；基质/胶原蛋白-I的1:1混合物；pA，聚腺苷酸化信号序列；胸腺嘧啶激酶；tGFP，涡轮绿荧光蛋白；tRFP，涡轮红荧光蛋白
图4
图4。表达K14和K8报告基因的转基因小鼠的产生和鉴定。
（A） 流式细胞术分析对照组或K14.tRPT/K8.tGPD双阳性转基因小鼠乳腺细胞的基质、基底和腔室。对于每种类型的小鼠，第一个点图显示每个细胞室中的总人口，而第二个点图仅显示对报告者呈阳性的细胞。门是根据阴性对照设置的，用假彩色点表示报告阳性细胞。（B） 荧光IHC显示K8.tGPD阳性小鼠肺中tGFP与内源性K8共定位（上面板）。下部面板显示未检测到tGFP的WT小鼠的对照染色；比例尺10μm。（C） 阳性和阴性小鼠在指定的时间点（天）腹腔注射高剂量（“H”；GCV=100μg/g；DT=50 ng/g）或低剂量（“L”；GCV=20μg/g；DT=10 ng/g）。DAPI，4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；DT，白喉毒素；GCV，更昔洛韦；IHC、免疫组织化学；腹腔注射；K8.tGPD、角蛋白-8启动子、涡轮绿荧光蛋白和白喉毒素受体；K14.tRPT、角蛋白-14启动子、涡轮红荧光蛋白和单纯疱疹病毒胸苷激酶；tGFP，涡轮绿荧光蛋白；WT，野生型
图5
图5。与K14−细胞相比，K14+细胞分泌更多的Col6a1，并表达更高水平的Amigo2。
（A） K14.GFP+或K14.GFP报告细胞系分泌蛋白的抗Col6a1免疫印迹。对CM进行浓缩并分析其分泌的Col6a1水平。ITGB1也存在于分泌体中，用于负荷控制。（B） RT-PCR用于阿米戈2K14+和K14−细胞的mRNA水平。结果显示了3个独立实验的平均值±SD，第页=0.0126（成对）t吨测试。（C） 通过蛋白质印迹检测K14+和K14-细胞裂解物中Amigo2蛋白水平。量化3个独立实验，第页成对<0.0001t吨测试；显示平均值±SD。（D） H3K27Ac芯片显示了K14+和K14−在阿米戈2轨迹。（E） 自强慢病毒K14.tRPT（上图）和K8.tGPD记者（下图）的漫画。（F） RT-PCR分析阿米戈2K14+或K14−人乳腺癌细胞株HCC1143的mRNA表达。三份独立实验的量化第页=0.0148（成对）t吨测试；显示平均值±SD。（G） TP53突变体和TP53 WT乳腺癌的Kaplan-Meier图显示两者之间的关系阿米戈2表达和无复发生存。Amigo2，两性激素诱导蛋白2；芯片，染色质免疫沉淀；CM，条件培养基；Col6a1，胶原VI亚单位A；DTR，白喉毒素受体；EF-1α,伸长率1α; 绿色荧光蛋白；H3K27Ac，组蛋白3赖氨酸27；ITGB1，整合素β-1；K、 细胞角蛋白；K8.tGPD、角蛋白-8启动子、涡轮绿荧光蛋白和白喉毒素受体；K14.tRPT、角蛋白-14启动子、涡轮红荧光蛋白和单纯疱疹病毒胸苷激酶；LTR，长末端重复；RT-PCR，实时PCR；tBFP，涡轮蓝荧光蛋白；tGFP，涡轮绿荧光蛋白；胸腺嘧啶激酶；tRFP，涡轮红荧光蛋白；WT，野生型。
图6
图6。Amigo2是乳腺癌细胞侵袭的新调节器。
（A） 对照细胞（VECT）或AM2 KD中Amigo2蛋白水平（western blot）和mRNA表达（RT-PCR）。结果按GAPDH标准化。（B） 4T1细胞VECT或AM2 KD的单层（上面板）或3D（下面板）图像。（C） 对3个独立实验的侵入性结构进行了量化；显示平均值±SEM；第页=0.0044（未配对）t吨测试。（D） 对照组（AM2 KD-VECT和K14-VECT）或Amigo2拯救组（AM2-KD-RE和K14-AM2）4T1细胞系的Western blot分析。（E） 单层（上面板）或3D（下面板）中生长的细胞图像。（F） 3个独立实验中侵入性结构的量化；显示平均值±SEM；第页=0.0024（未配对）t吨测试。接种后第4天拍摄M/Col-I培养物的所有3D图像。二维标尺100μm；3D比例尺200μm。3D，三维；AM2 KD、Amigo2敲除细胞；AM2 KD-RE，阿米戈2击倒救援；AM2 KD-VECT，阿米戈2击倒控制矢量；Amigo2、两性激素诱导蛋白2 GAPDH、甘油醛3-磷酸脱氢酶；K14-AM2，细胞角蛋白14阴性阿米戈2过度表达细胞；M/Col-I，基质/胶原蛋白-I的1:1混合物；RT-PCR，实时PCR；VECT，控制向量
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