Down-regulation of microRNA-23b aggravates LPS-induced inflammatory injury in chondrogenic ATDC5 cells by targeting PDCD4

doi:10.22038/IJBMS.2018.25856.6364

.2018年5月；21(5):529-535.

doi:10.22038/IJBMS.2018.25856.6364。

microRNA-23b下调通过靶向PDCD4加重LPS诱导的软骨生成性ATDC5细胞炎症损伤

杨忠猛¹, 玉星堂¹, Qing Zhao（清照）¹, 华鼎路¹, 徐国勇¹

附属公司

PMID： 29922435
预防性维修识别码：下午6点00224分
内政部： 10.22038/IJBMS.2018.25856.6364

microRNA-23b下调通过靶向PDCD4加重LPS诱导的软骨生成性ATDC5细胞炎症损伤

杨忠猛等。伊朗基础医学杂志. 2018年5月.

.2018年5月；21(5):529-535.

doi:10.22038/IJBMS.2018.2585.66364。

作者

杨忠猛¹, 玉星堂¹, Qing Zhao（清照）¹, 华鼎路¹, 徐国勇¹

附属

¹中山大学附属第五医院骨科，广东珠海519000。

PMID： 29922435
预防性维修识别码： PMC6000224型
内政部： 10.22038/IJBMS.2018.25856.6364

摘要

目标：以关节软骨退化为特征的骨关节炎（OA）是导致残疾的主要原因。作为软骨中唯一存在的细胞类型，软骨细胞在OA的进展中起着重要作用。在我们的研究中，我们旨在探讨miR-23b在脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤中的作用。

材料和方法：通过细胞活力的丧失、细胞凋亡的增强、凋亡相关蛋白的改变和炎症细胞因子的释放来评估LPS诱导的ATDC5细胞的细胞损伤。然后，通过qRT-PCR评估LPS治疗后miR-23b的水平。接下来，研究miR-23b异常表达对脂多糖诱导的炎症损伤的影响。通过信息学虚拟筛选miR-23b的可能靶基因，并通过荧光素酶分析进行验证。随后，验证miR-23b是否通过调节靶基因发挥作用。最后对涉及的信号通路进行了研究。

结果：LPS治疗降低了细胞活力，但增加了细胞凋亡和炎性细胞因子的释放。MiR-23b被LPS下调，其过度表达减轻了LPS诱导的炎症损伤。经miR-23b表达负调控的PDCD4被证实为miR-23b的靶基因。以下实验表明，miR-23b通过下调PDCD4的表达减轻了LPS诱导的细胞损伤。PDCD4过度表达增加了NF-κB途径中关键激酶的磷酸化水平以及Notch途径中关键酶的表达。

结论：LPS治疗后MiR-23b表达下调，其过表达通过靶向PDCD4改善LPS诱导的ATDC5细胞炎症损伤，PDCD4可激活NF-κB/Notch通路。

关键词：炎症损伤；NF-κB/缺口；骨关节炎；PDCD4；microRNA-23b。

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数字

图1
脂多糖（LPS）诱导ATDC5细胞炎症损伤。A.通过细胞计数试剂盒-8测定法检测细胞活力。B、流式细胞术检测细胞凋亡。C.通过Western blot分析测定凋亡相关蛋白的表达。D.通过qRT-PCR评估炎症细胞因子的相对mRNA表达水平。通过酶联免疫吸附试验测定炎性细胞因子的E-H蛋白表达水平。D-H的LPS剂量为5μg/ml，LPS治疗时间为5小时。数据表示为平均值±标准偏差。**，*P（P）*<0.01; ***,*P（P）*<0.001。P-，专业；C-，劈开

图2
小RNA（miR）-23b被脂多糖（LPS）下调。通过qRT-PCR测定miR-23b的水平。数据表示为平均值±标准偏差*，*P（P）*<0.05

图3
用不同miR转染细胞后，MicroRNA（miR）-23b异常表达。通过qRT-PCR测定miR-23b的水平。数据表示为平均值±标准偏差。**，*P（P）*<0.01; ***,*P（P）*< 0.001. NC，miR-23b抑制剂阴性对照

图4
microRNA（miR）-23b的过度表达减轻了脂多糖（LPS）诱导的炎症损伤，但miR-23b的沉默加重了炎症损伤。A.通过细胞计数试剂盒-8测定细胞活力。B.流式细胞术检测细胞凋亡。C.通过Western blot分析测定凋亡相关蛋白的表达。D.通过qRT-PCR评估炎症细胞因子的相对mRNA表达水平。通过酶联免疫吸附试验测定炎性细胞因子的E-H蛋白表达水平。LPS治疗持续时间（5μg/ml）为5小时。数据表示为平均值±标准偏差。*，*P（P）*<0.05；**，*P（P）*<0.01; ***,*P（P）*<0.001。P-，专业；C-，解理

图5
程序性细胞死亡4（PDCD4）是microRNA（miR）-23b的靶点。分别用qRT-PCR（A）和Western blot分析（B）检测PDCD4的相对mRNA和蛋白表达。C.荧光素酶活性通过荧光素素酶试验测定。数据表示为平均值±标准偏差*，*P（P）*<0.05; **,*P（P）*<0.01. NC，miR-23b抑制剂阴性对照；PDCD4-WT，pmirGlO载体，携带含有结合位点的野生型PDCD4 3'UTR片段；PDCD4-MUT，突变型PDCD4-WT

图6
MicroRNA（miR）-23b过表达通过下调程序性细胞死亡4（PDCD4）发挥作用。A.通过细胞计数试剂盒-8测定细胞活力。B、流式细胞术检测细胞凋亡。C.通过Western blot分析检测凋亡相关蛋白的表达。D.通过qRT-PCR评估炎症细胞因子的相对mRNA表达水平。通过酶联免疫吸附试验测定炎性细胞因子的E-H蛋白表达水平。LPS治疗持续时间（5μg/ml）为5小时。数据表示为平均值±标准偏差。*，*P（P）*<0.05; **,*P（P）*<0.01; ***,*P（P）*<0.001。脂多糖；P-，专业；C-，劈开；包含全长PDCD4序列的pEX-PDCD4，pEX-2质粒

图7
程序性细胞死亡4（PDCD4）过度表达激活了具有LPS诱导炎症损伤的ATDC5细胞中的NF-κB和Notch信号通路。用pEX-2（pEX）、pEX-PDCD4、siNC或si-PDCD5转染ATDC5细胞，然后用5μg/ml LPS刺激5小时。通过Western blot分析评估关键激酶的蛋白表达。脂多糖；pEX-PDCD4，包含全长PDCD4序列的pEX；si-PDCD4、PDCD4特异性小干扰RNA；siNC，si-PDCD4的阴性对照；p-，磷酸化；IκBα，核因子κBα抑制剂

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