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.2018年8月1日；26(8):1983-1995.
doi:10.1016/j.ymthe.2018.05.016。 Epub 2018年6月15日。

特异性抑制肝乳酸脱氢酶降低原发性高草酸尿小鼠模型草酸生成

赖成荣（Chengjung Lai） 1, 娜塔莉·帕塞尔 2, 杰西卡·吉尔特 2, 乌特萨夫·萨克塞纳 2, Wei Zhou公司 2, 迈克尔·迪尔斯 2, 罗汉·迪万基 2, Chaitali Dutta公司 2, 马丁·科瑟 2, 奈姆·纳齐夫 2, 雷切尔·斯托尔 2, 博扬·金 2, 克里斯蒂娜·马丁·希格拉斯 三, 爱德华多·萨利多 三, 王伟民 2, 马克·阿布拉姆斯 2, 亨利克·杜德克 2, 鲍勃·布朗 4
附属公司

特异性抑制肝乳酸脱氢酶降低原发性高草酸尿小鼠模型草酸生成

赖成荣（Chengjung Lai）等。 分子治疗. .

摘要

原发性高草酸尿症（PHs）是一种常染色体隐性遗传疾病，由草酸生产过剩导致肾脏草酸钙沉淀，最终导致终末期肾病。治疗PHs的一个有希望的策略是通过底物还原疗法，通过抑制肝脏特异性乙醇酸氧化酶（GO）来减少肝脏草酸的生成，GO控制乙醇酸转化为乙醛酸，乙醛酸是草酸的主要前体。另外，减少肝乳酸脱氢酶（LDH）的表达量，这是将乙醛酸转化为草酸的关键酶，应该可以直接防止PH患者体内草酸的积累。利用RNAi，我们在哺乳动物中提供了第一个体内证据，证明LDH是负责将乙醛酸转化为草酸的关键酶。此外，我们证明，在PH 1型（PH1）和2型（PH2）基因工程小鼠模型以及化学诱导的PH小鼠模型中，肝LDH的减少可实现有效的草酸盐减少并防止草酸钙晶体沉积。抑制小鼠肝脏LDH不会导致循环肝酶的急性升高、乳酸酸中毒或劳力性肌病，这表明需要进一步评估肝脏特异性抑制LDH作为治疗PH1和PH2的潜在方法。

关键词：RNAi；草酸钙；终末期肾病；乙醇酸氧化酶；肾结石；乳酸脱氢酶；原发性高草酸尿；小干扰RNA。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
靶向siRNAs的鉴定利达或好1PH（A）草酸盐代谢途径研究综述。（B） siRNA靶向利达与GalNAc残基结合，通过皮下注射靶向肝细胞（指定为LDHA-1）的配体介导的靶向性有ED50在野生型小鼠中约为1.6 mg/kg（另见图S1）。（C） siRNA靶向好1与GalNAc残基结合，通过皮下注射靶向肝细胞（指定为HAO1-1）的配体介导的靶向性有ED50在野生型小鼠中约1.0 mg/kg（另见图S1）。数据以平均值±标准偏差表示。在每个剂量水平下，与PBS治疗组相比，未配对t检验具有统计显著性。（D） 男阿格斯特1−/−小鼠单次皮下注射5 mg/kg LDHA-1或PBS（n=5）。每周收集尿样，并分析草酸盐（LC/MS）和肌酐水平。野生型和Agxt1公司−/−指示小鼠。数据以平均值±标准偏差表示。每个时间点相对于PBS治疗组的统计显著性的未配对t检验*p<0.05**p<0.01****p<0.0001。AGT，丙氨酸-谷氨酸转氨酶；GO，乙醛酸氧化酶；GRHPR，乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原蛋白酶；HAO1，羟基酸氧化酶1；HOGA1，4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶1；羟脯氨酸脱氢酶；乳酸脱氢酶。
图2
图2
LDHA-1预防EG诱导的PH1小鼠模型雄性体内草酸钙沉积Agxt1公司−/−给小鼠自由饮用1.4%或2.8%的EG，每周皮下注射5 mg/kg LDHA-1。使用代谢笼收集尿液样本，并分析草酸和肌酐水平。将喂食1.4%乙二醇8周的小鼠处死，并在第8周收集肾脏以评估CaOx晶体。（A） 经PBS或LDHA-1治疗的EG-fed小鼠的尿液草酸水平。数据以平均值±标准偏差表示。每个时间点相对于PBS治疗组的统计显著性的未配对t检验**p<0.01***p＜0.001****p<0.0001。野生型小鼠尿草酸水平。（B） 采用Pizzolato染色法对肾组织进行组织学分析以检测CaOx晶体。代表性图片展示了对照组小鼠如何利用Pizzolato的CaOx方法，通过偏振光和阳性染色，形成具有特征性双折射的CaOx晶体。对照组EG-fed小鼠表现出不同的CaOx沉积。此处显示了PBS组动物中损伤最严重的典型部分。肾脏切片的附加图像和定量分析见图S2。比例尺代表100μm（第一行和第二行）、200μm（第三行）或1 mm（底行）。
图3
图3
抑制肝LDH和GO降低PH1小鼠模型尿草酸好1和利达将分别命名为HAO1-1和LDHA-1的siRNA结合物皮下注射到男性体内Agxt1公司−/−小鼠单剂量为0.3、0.4、0.6、0.7或3 mg/kg（HAO1-1）或0.5、0.8、1、3或5 mg/kg（LDHA-1）。（A） western blot分析结果显示，在选定剂量水平下，HAO1-1和LDHA-1分别对靶蛋白、GO和LDH的影响。显示了每种剂量水平下，每组四至五只动物肝脏中与PBS组相比的相对蛋白质表达水平，并指出了剂量水平。每条车道代表每组中的一只动物。（B）LDHA-1-和（C）HAO1-1-治疗组尿草酸水平的LC/MS分析（平均值±SD）Agxt1公司−/−老鼠。（D） 对接受不同剂量LDHA-1或HAO1-1的部分动物（每组5只）实施安乐死，并分析其第10天肝脏中的相对目标蛋白表达（平均值±SD），与第14天尿草酸水平归一化为肌酐（平均值？SD）相比。第10天和第14天分别代表蛋白质和草酸盐减少的最低点。与给药前相关的统计学显著性的单向方差分析检验*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。
图4
图4
将NHPs HAO1-1或PBS中GO酶减少与乙醇酸升高之间的非线性关系作为对照，以指定的剂量水平和时间表皮下注射到食蟹猴体内。在指定的时间点收集肝脏活检以分析mRNA和蛋白质。还收集血浆样本，并用LC/MS分析乙醇酸水平。每组包含五只动物。箭头表示注射时间。（A） RT-PCR和western blot的定量结果好1HAO1-1处理后的mRNA和GO蛋白。PBS或HAO1-1处理的血浆乙醇酸的LC/MS分析。（B） 用于（A）所示定量结果的Western blot分析。（C） 在第4周、第11周、第19周和第26周，分析单个动物的GO蛋白表达和血浆乙醇酸水平。数据以平均值±标准差表示。各时间点相对于PBS治疗组的统计显著性的单向方差分析检验*p<0.05**p<0.01***p＜0.001****p<0.0001。ns，不显著；Q2W，每2周一次，Q4W，每4周一次。
图5
图5
靶向肝LDH降低AGXT-和GRHPR-缺乏小鼠摄入EG雄性的草酸盐生成Agxt1公司−/−每周向小鼠皮下注射针对这两种基因的siRNA结合物Grhpr公司和利达，GRHPR-1（10 mg/kg）和LDHA-1（5 mg/kg），分别存在（蓝色圆圈，n=5）或不存在（橙色正方形，n=10）0.7%的EG。收集尿液样本，通过LC/MS方法分析尿液（A）草酸盐和（B）乙醇酸盐水平。数据以平均值±标准差表示。与前剂量相关的统计显著性的单向方差分析检验*p<0.05***p<0.001****p<0.0001。
图6
图6
LDHA-1降低PH2、EG和羟脯氨酸小鼠模型（A）雄性小鼠的尿液草酸盐水平Grhpr公司−/−小鼠皮下注射PBS作为对照，与HAO1-1或LDHA-1相比，每周注射5mg/kg（每组5只）。在第19天、第20天、第26天和第27天收集尿样，并通过酶法分析尿液草酸和肌酐水平。数据以平均值±标准偏差表示。使用第19、20、26和27天测量值的平均值，对各组（PBS与LDHA-1、PBS与HAO-1、LDHA-1与HAO1-1）进行未配对t检验，以确定统计显著性。（B） 第二个PH2小鼠模型是使用RNAi方法产生的，重复给药Grhpr公司在雄性C57BL/6野生型小鼠中，在脂质纳米颗粒（LNP）中以每2周1mg/kg配制的siRNA。siRNAs靶向好1（n=9），利达（n=10），或海普德从第20天开始每周静脉注射0.3 mg/kg LNP配制的（n=6），持续4周。数据以平均值±标准偏差表示。与PBS治疗组相比，未配对t检验具有统计学意义。（C和D）雄性C57BL/6野生型小鼠在饮用水中喂养0.7%乙二醇，同时每周皮下注射5 mg/kg的PBS对照（n=10）、LDHA-1（n=100）或HAO1-1（n=110）。对治疗动物的尿液草酸（C）和尿液乙醇酸（D）水平进行LC/MS分析比较。人工采集尿样。数据以平均值±标准差表示。与前剂量相关的统计显著性的单向方差分析检验。（E） 雄性C57BL/6小鼠每周注射Grhpr公司siRNA诱导PH2模型尿草酸升高，无论是否每周进行LDHA-1治疗。如有指示，小鼠也被喂食0.7%的乙二醇4周。尿草酸的LC/MS分析显示为平均值±SD（n=5）。对照组相关统计显著性的未配对t检验。（F） 雄性C57BL/6小鼠每周注射LDHA-1。与第三次给药同时，在他们的饮食中添加1%的羟脯氨酸。第四周末采集尿液样本，用LC/MS分析尿液草酸水平。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）。对照组相关统计显著性的未配对t检验*p<0.05**p＜0.01***p<0.001****p<0.0001。ns，无显著性。
图7
图7
LDHA公司siRNAs在NHP和人源化肝嵌合小鼠中活性NHP和人类特异性LDHA公司按照指定的给药方案，将siRNA LDHA-2皮下注射到食蟹猴体内。收集肝脏活检，分析指定时间点LDH的靶mRNA（A）和蛋白质水平（B和C）以及酶活性（D）。箭头表示siRNA注射的时间。（B） western blot分析的定量结果如（C）所示。（B–D）数据表示为平均值±标准差。与给药前相比的统计显著性的单向方差分析检验。（E） 人源化肝脏的PXB小鼠每周注射5 mg/kg LDHA-2（n=3）或PBS作为对照（n=3）。在最后一次给药后10天采集肝脏样本，以测量LDHA公司信使核糖核酸抑制。使用人类或小鼠特异性引物进行RT-PCR分析。数据表示为平均值±SD（n=5）。对照组相关统计显著性的未配对t检验*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。ns，不显著；Q2W，每2周一次；Q4W，每4周一次。
图8
图8
短期肝特异性抑制利达野生型和Agxt1公司−/−小鼠被给予六周剂量的LDHA-1，其剂量水平为所指示的剂量水平。最后一次给药24小时后采集血液样本以及肝脏、肾脏和皮肤组织样本。（A）利达通过RT-PCR分析测定野生型小鼠的mRNA表达。每组包含五只动物。（B）利达通过RT-PCR分析测定mRNA表达Agxt1公司−/−老鼠。每组包含三只雄性和三只雌性动物。在（C）野生型或（D）中分析血浆乳酸银x1t−/−不同剂量的LDHA-1小鼠。（E） 的表达式利达对女性肝脏、肾脏、皮肤和子宫中的mRNA进行了分析Agxt1公司−/−用每周5次剂量为5mg/kg的LDHA-1治疗小鼠。分析每只动物的表达水平。数据以平均值±标准差表示。单因素方差分析（A-D）或非配对t检验（E）表示与PBS治疗组相关的统计显著性*p<0.05**p<0.01****p<0.0001。ns，无显著性。
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