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.2018年5月30日9:1202。
doi:10.3389/fimmu.2018.01202。 2018年eCollection。

α-1抗胰蛋白酶减轻视网膜变性中M1小胶质细胞介导的神经炎症

田洲 1, 黄紫晶 1, 朱晓伟 1, 孙晓伟 1, 刘燕（Yan Liu） 1, 必成 1, 梅丽 1, 刘益智 1, 昌河 1, 刘夏林 1
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α-1抗胰蛋白酶减轻视网膜变性中M1小胶质细胞介导的神经炎症

田洲等。 前部免疫. .

摘要

神经退行性疾病是一组以进行性神经元死亡为特征的疾病，与小胶质细胞介导的神经炎症有关。最近，神经炎症被认为是许多神经退行性疾病的一个有希望的治疗靶点。α-1抗胰蛋白酶（AAT）是一种新型免疫调节剂，可用于自身免疫性疾病和移植，但其对神经炎症和神经变性的影响尚不清楚。本研究旨在探讨AAT对rd1小鼠模型中小胶质细胞介导的神经炎症和视网膜变性的影响。我们发现，rd1视网膜中AAT的表达降低，并且补充AAT对视网膜变性具有一定的保护作用，表现为视网膜电图分析中光感受器核数量增加，波幅增大。值得注意的是，AAT将小胶质细胞表型从促炎症M1（CD16/CD32）转移+、iNOS+)抗炎M2（CD206+，精氨酸1+)两者都有体内和在体外强调了AAT在神经退行性变期间对小胶质细胞极化进行免疫调节的概念。此外，AAT抑制STAT1的激活，促进IRF4的表达，同时抑制IRF8的表达，表明这些信号通路参与AAT免疫调节。总之，我们的数据为AAT通过免疫调节小胶质细胞极化发挥新的保护作用提供了证据。AAT减轻神经炎症可能有助于延缓rd1小鼠的神经退行性变。

关键词：α-1抗胰蛋白酶；免疫调节；小胶质细胞极化；神经炎症；rd1小鼠。

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数字

图1
图1
rd1小鼠α-1抗胰蛋白酶（AAT）表达降低。（A、B）实时PCR（A）和western blot（B）结果显示，与C57对照组相比，rd1小鼠在P14时视网膜中AAT的表达降低***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。（C）C57视网膜中有一些细胞与AAT（红色）和IBA1（绿色）共同染色，而在P14时rd1小鼠的视网膜中观察到AAT缺乏。（D）视网膜切片的免疫荧光显示，C57小鼠的AAT主要分布在内核层，而rd1小鼠缺乏AAT的表达。（E、F）在视网膜整块中，随着rd1小鼠疾病从P4发展到P20，AAT的表达降低，而C57小鼠在同一时间内AAT表达稳定。值得注意的是，AAT主要与CD68联合标记（E）和CD11b（F），也是视网膜中小胶质细胞的标记物，轻微含Brn3a+视网膜神经节细胞（F），但不适用于GFAP+星形胶质细胞/Müller细胞（E）.恐惧栏，50 微米。
图2
图2
α-1抗胰蛋白酶（AAT）减少rd1小鼠的视网膜变性。（A）研究中使用的扫描模型。6内25次线性扫描 × 3毫米2在鼻视网膜和颞视网膜获得了视神经盘附近的区域。（B）测量半径为1.5的圆形区域的平均视网膜厚度 mm，居中3 距离视神经盘mm。（C）C57小鼠的视网膜结构组织良好，有多层(n个 = 6） 而PBS治疗的rd1小鼠在P16时，ONL、ELM和IS/OS连接层不太明显。然而，经AAT处理的rd1显示出可见的低反射ONL层。缩写：NFL，神经纤维层；IPL，内丛状层；INL，内核层；外丛状层；ONL，外核层；ELM，外部限制膜；IS/OS，内段/外段；视网膜色素上皮。视网膜体积（D）和厚度（E）与PBS处理的小鼠相比，AAT处理的rd1小鼠中的含量增加。n个 = 每组9只小鼠***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。
图3
图3
α-1抗胰蛋白酶（AAT）减轻rd1小鼠视网膜厚度的降低。（A）H&E染色的视网膜石蜡切片中中央[位置1]、中周边[位置2]和周边[位置3]区域的全景图。代表性图像显示，与P16时PBS治疗组相比，经AAT治疗的rd1小鼠的外核层（ONL）细胞核更致密，视网膜厚度更厚。恐怖酒吧，50 微米。（B）与PBS对照组相比，AAT治疗后，ONL中指定位置的细胞核数量显著增加。（C）与PBS处理的对照组相比，AAT处理的rd1小鼠的中心、中周边和周边区域的视网膜总厚度增加。每个视网膜的六个切片和每组的三个视网膜用于分析*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。
图4
图4
α-1抗胰蛋白酶（AAT）补充剂保护rd1小鼠的视网膜功能。（A、B）在3.0 log cd•s/m和10.0 log cd·s/m的光照强度下，使用单次闪光记录在P16通过视网膜电图测量视网膜功能2分别是。C57小鼠出现典型的a波和b波反应(n个 = 6） 而PBS治疗的rd1小鼠在各种暗视测试条件下几乎无法检测到a波或b波的振幅。（C、D）AAT治疗导致rd1小鼠的a波轻度增加，但b波振幅显著升高。n个 = 每组9只小鼠*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。
图5
图5
α-1抗胰蛋白酶（AAT）对变性棒的保护作用。（A）视网膜切片上的代表性免疫染色图像显示，PBS处理的rd1小鼠的视紫红质阳性视杆光感受器分散，而AAT处理后的外核层广泛分布且组织良好。隧道+AAT补充组凋亡细胞减少，而IBA1的数量+与PBS处理组相比，小胶质细胞也减少。位置“中心”是指图3A中的全景视图区域1，“外围”是指区域3。吓唬栏，50 微米。TUNEL的统计分析+ （B）和IBA1+单元格（C）结果表明，无论是在中心还是在外围，它们的数量都显著减少。每个视网膜的六个切片和每组的三个视网膜用于分析**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。
图6
图6
α-1抗胰蛋白酶（AAT）在视网膜变性过程中抑制促炎性M1小胶质细胞极化。（A）在视网膜整体安装中，CD16/32的数量+IBA1级+补充AAT后，中央、中周边和周边视网膜中的M1小胶质细胞显著减少。吓唬栏，50 微米。被判刑是卑鄙的 ± 六只眼睛的三个视野/眼睛的SEM*第页 < 0.05（双尾非配对t吨-测试）。（B）在视网膜切片中，CD16/32+IBA1级+PBS治疗组外核层小胶质细胞明显聚集，而CD16/32的数量+IBA1级+AAT治疗组炎症前小胶质细胞显著减少。吓唬栏，20 微米。（C）在过氧化氢刺激氧化应激下培养的小胶质细胞中，AAT的补充显著抑制了小胶质细胞的促炎症M1表型，表现为较少的CD16/32+细胞与IBA1共染+细胞。恐怖酒吧，20 微米。
图7
图7
在补充α-1抗胰蛋白酶（AAT）的情况下，小胶质细胞倾向于抗炎M2表型。（A）在视网膜中，CD206的数量+IBA1级+与PBS处理的小鼠相比，AAT处理组的小胶质细胞显著增加，尤其是在中央和中周边视网膜。（B）精氨酸1+PBS处理的rd1视网膜中缺少另一个M2小胶质细胞标记物细胞，而补充AAT后，这些M2小神经胶质细胞出现并主要集中在中周边区域。吓唬栏，50 微米。描述的是平均值 ± 三个视野/六只眼睛的SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01（双尾未配对t吨-测试）。（C）免疫染色结果显示，过氧化氢刺激培养的BV2小胶质细胞后，iNOS升高，特别是在细胞质中表达。在AAT治疗的小胶质细胞中，iNOS的表达显著降低，Arg1的表达也明显上调。吓唬栏，20 微米。（D）Western blot显示AAT下调iNOS的表达，上调iNOS拮抗因子Arg1的表达。
图8
图8
α-1抗胰蛋白酶（AAT）调节IRF4/8活化和STAT1磷酸化体内和在体外.（A、B）Western blot显示，在AAT处理的rd1小鼠视网膜中，IRF8表达显著降低，而IRF4表达略有增加。此外，补充AAT后STAT1信号被抑制。（C、D） 体外在原代培养的小胶质细胞中，过氧化氢刺激上调了IRF8的表达水平，促进了STAT1的磷酸化，而AAT处理则逆转了IRF7和STAT1表达下降、IRF4升高的趋势。n个 = 3. *第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾未配对t吨-测试）。
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