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.2018年5月；15(5):6225-6232.
doi:10.3892/ol.2018.8152。 Epub 2018年3月1日。

黏附斑激酶促进骨肉瘤患者的进展并预测不良临床结局

顾华杰 1, 滨州 1
附属公司

黏附斑激酶促进骨肉瘤患者的进展并预测不良临床结局

谷华杰等。 肿瘤Lett. 2018年5月.

摘要

骨肉瘤（OS）是一种致命的肌肉骨骼肿瘤，通常会导致肺转移疾病。手术和化疗等传统疗法对某些OS患者不是有效的治疗方式；因此，研究OS的分子机制对开发新型治疗药物至关重要。先前的研究报道，黏着斑激酶（FAK）与多种人类恶性肿瘤相关。因此，为了研究FAK在OS中的生物学功能，本研究采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测了FAK在OS细胞系、OS组织和配对正常组织标本中的表达水平。FAK表达式在体外用小干扰RNA（siRNA）阻断，观察OS细胞的侵袭、增殖和凋亡趋势。通过western blotting检测磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK1）、AKT和BRAF蛋白水平，分析FAK缺失对AKT和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的影响。与OS组织和细胞系相比，配对正常组织中FAK mRNA水平显著降低。OS细胞的侵袭能力和增殖潜能由于短暂的在体外FAK siRNA转染。流式细胞术和western blotting分析也表明，FAK表达降低促进了OS细胞的凋亡。FAK表达降低导致磷酸化（p）-AKT、p-PDK1和p-BRAF蛋白水平下调。高FAK表达水平与OS患者晚期Enneking分期的临床病理特征（P<0.001）和复发（P=0.041）呈正相关。总之，这些数据表明FAK是OS的重要诊断生物标志物，FAK siRNA治疗可能是OS治疗的一种潜在的有前景的方法。

关键词：粘着斑激酶；迁移；骨肉瘤；预后；增殖。

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数字

图1。
图1。
FAK表达水平的RT-qPCR分析（归一化为GAPDH）。（A） OS组织样本中FAK mRNA水平与正常邻近组织样本相比显著升高（P<0.001）。（B） 与正常邻近组织相比，MG-63和U2-OS细胞系中FAK mRNA表达水平显著上调（P<0.001）。数据以平均值±标准差表示***P<0.01。粘着斑激酶；OS，骨肉瘤。
图2。
图2。
未转染的MG-63细胞和用非沉默加扰siRNA或FAK-siRNA转染的MG-63细胞的细胞活力比较与未转染MG-63细胞相比；（B） CCK-8分析表明，与用干扰对照siRNA处理的细胞系相比，FAK siRNA转染后48和72小时，OS细胞的增殖受到抑制（P<0.01 vs.对照）。数据以平均值±标准偏差的形式表示。数据收集自独立进行的实验*与MG-63或NC组相比，P<0.05和**P<0.01。粘着斑激酶；NC，阴性对照；骨肉瘤；CCK-8，细胞计数试剂盒-8。
图3。
图3。
siRNA诱导的FAK敲除抑制MG-63细胞的侵袭。（A） Transwell侵袭试验的代表性图像表明，FAK siRNA转染后MG-63细胞的侵袭受到抑制（放大倍数×200）。（B） 与NC组和未转染MG-63细胞相比，FAK siRNA转染MG-6 3细胞的侵袭细胞数显著减少（P<0.001）。所有实验均独立进行，一式三份***P<0.001（正常与FAK耗竭；NC与FAK消耗）。粘着斑激酶；NC，阴性对照。
图4。
图4。
Annexin V-FITC/PI染色后用流式细胞仪进行早期凋亡分析。（A） 非转染MG-63细胞的早期凋亡分析；（B） 转染阴性对照siRNA的MG-63细胞早期凋亡分析；（C） 转染FAK siRNA的MG-63细胞早期凋亡分析；异硫氰酸荧光素；PI，碘化丙啶；UL，左上；UR，右上；LL，左下方；左后，右下。
图5。
图5。
FAK缺失诱导OS细胞凋亡。对于转染FAK siRNA的OS细胞，Bax（一种促凋亡调节物）的水平上调，而Bcl-2（一种抗凋亡调节器）的水平下调。GAPDH被用作内部控制。粘着斑激酶；NC，阴性对照。
图6。
图6。
AKT和MAPK信号通路相关蛋白的Western blot分析。粘着斑激酶；NC，阴性对照。
图7。
图7。
OS组织和正常邻近组织样本中FAK的免疫组织化学染色。配对正常组织（A和B）显示FAK表达的代表性图像（阴性）；（C和D）OS组织（弱染色）；（E和F）OS组织切片（中间染色）；和（G和H）OS切片（强染色）。使用光学显微镜以×400（左）和×200（右）的放大倍数显示代表性图像。粘着斑激酶；OS，骨肉瘤。
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