MicroRNA-148b Targets the TGF-β Pathway to Regulate Angiogenesis and Endothelial-to-Mesenchymal Transition during Skin Wound Healing

doi:10.1016/j.ymthe.2018.05.002

.2018年8月1日；26(8):1996-2007.

doi:10.1016/j.ymthe.2018.05.002。 Epub 2018年5月8日。

MicroRNA-148b靶向TGF-β途径调节皮肤创伤愈合过程中的血管生成和内皮细胞-间充质转化

附属公司

¹英国爱丁堡大学QMRI大学/英国心脏基金会心血管科学中心，爱丁堡EH16 4TJ。
²英国心脏基金会卓越研究中心，英国牛津大学拉德克利夫医学部心血管医学部威康信托人类遗传学中心，牛津OX3 7BN。
^三大学/英国心脏基金会心血管科学中心，英国爱丁堡大学QMRI，爱丁堡EH16 4TJ。电子地址：a.caporali@ed.ac.uk。

PMID： 29843955
预防性维修识别码： PMC6094488型
内政部： 2016年10月10日/j.ymthe.2018.05.002

MicroRNA-148b靶向TGF-β通路，调节皮肤创伤愈合过程中的血管生成和内皮-间充质转化

弗拉迪斯拉夫·米西亚尼诺夫等。分子治疗. 2018.

.2018年8月1日；26(8):1996-2007.

doi:10.1016/j.ymthe.2018.05.002。 Epub 2018年5月8日。

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¹英国爱丁堡大学QMRI大学/英国心脏基金会心血管科学中心，爱丁堡EH16 4TJ。
²英国心脏基金会卓越研究中心，英国牛津大学拉德克利夫医学部心血管医学部威康信托人类遗传学中心，牛津OX3 7BN。
^三大学/英国心脏基金会心血管科学中心，英国爱丁堡大学QMRI，爱丁堡EH16 4TJ。电子地址：a.caporali@ed.ac.uk。

PMID： 29843955
预防性维修识别码： PMC6094488型
内政部： 2016年10月10日/j.ymthe.2018.05.002

摘要

转化生长因子β（TGF-β）对内皮细胞（EC）稳态的调节至关重要。TGF-β信号的干扰导致血管系统的病理状况，导致心血管疾病和纤维化疾病。TGF-β途径在内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）中至关重要，但我们对TGF-。本研究应用功能增益和损耗方法以及皮肤创伤愈合的体内模型，证明miR-148b调节TGF-β信号传导，并在EndMT中发挥关键作用，靶向TGFB2和SMAD2。miR-148b的过度表达增加了EC的迁移、增殖和血管生成，而其抑制促进了EndMT。细胞因子激发降低内皮细胞中miR-148b水平，同时通过SMAD2的调节促进EndMT。最后，在皮肤伤口愈合的小鼠模型中，miR-148b模拟物的递送促进了伤口血管化和加速闭合。相反，抑制miR-148b可增强伤口中的EndMT，导致伤口闭合受损，而SMAD2沉默可逆转这种情况。总之，这些结果首次证明miR-148b是控制EndMT和血管形成的关键因素。这为miR-148b在血管和组织修复中的治疗应用开辟了新的途径。

关键词：转化生长因子-β；血管生成；内皮-间充质转化；微RNA；伤口愈合。

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数字

图1
TGFB2和SMAD2是miR-148b靶基因（A）*生物信息学*使用TargetScan对TGFB2和SMAD2 3′UTR的分析确定了推定的miR-148b结合位点（蓝色）。（B）用miR-148b和以下质粒共同转染HEK293T细胞48小时后的荧光素酶活性：3′UTR-TGFB2、3′UTR-SMAD2和pMIR作为空质粒（n=5）。（C） miR-148b过度表达后TGFB2和SMAD2的相对基因表达（n=3）。（D） miR-148b模拟物转染与对照转染样品中TGFB2和SMAD2的Western blot分析；β-actin用作负荷控制（n=3）；用miR-148b模拟或对照寡核苷酸转染HUVEC 48小时。（E）用BrdU掺入法分析EC增殖（n=5）。（F） EC迁移报告为迁移速度（μm/hr）（n=5）。（G）代表性Matrigel分析图像和量化为总小管长度（n=5）；数值为平均值±SEM。*p<0.05**与实验b中的对照组和pMIR载体相比，p<0.01。采用未配对双尾Student t检验。

图2
miR-148b调节血管生成并加速伤口愈合（A）与未损伤皮肤相比，创伤后3天和7天miR-148 b的表达（n=5）。（B）左，受伤后0天和7天对照组和miR-148b模拟治疗伤口的代表性图像；比例尺，5 mm。右，伤口闭合程度表示为初始伤口面积的百分比（n=8）。（C）伤后5天拍摄典型的彩色激光多普勒图像。图表显示了小鼠的伤口灌注水平（计算为治疗组和对照组的血液流量之比；每组n=8）。（D）左，免疫组织化学法检测miR-148b模拟治疗或对照寡核苷酸治疗皮肤创面中的CD31和α-SMA；比例尺，100μm（放大400倍）。对，血管密度量化表示为CD31-阳性血管/mm²（n=8）。数值为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比p<0.01。采用未配对双尾学生t检验。

图3
miR-148b抑制诱导EndMT HUVEC转染抗miR-148 b或对照寡核苷酸48小时。（A）用BrdU掺入法分析EC增殖（n=5）。（B） EC迁移报告为迁移速度（μm/hr）（n=5）。（C） Matrigel分析定量为总小管长度（n=5）。（D） miR-148b或对照组HUVEC敲除中细胞膜电容的定量（n=5）。（E） TGFB2、SMAD2、CD31、VE-cadherin COL1A1、SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1/2、VIM、FSP-1和α-SMA的相对基因表达（n=3）。（F） TGFB2、SMAD2、p-SMAD2，SLUG，CD31，VE-cadherin，COL1A1和FSP-1的Western blot分析；β-actin用作负荷控制（n=3）。（G）免疫荧光图像显示CD31、VE-cadherin、COL1A1和FSP-1在抗miR-148b或对照转染细胞中的定位（n=3）；比例尺，50μm（放大400倍）。数值为平均值±SEM。*p<0.05**与对照组相比p<0.01。采用未配对双尾学生t检验。

图4
用TNF-α和IL-1β联合治疗ECs HUVEC中的慢性炎症下调miR-148b 6天。（A） TNF-α/IL-1β治疗后miR-148b表达水平。（B） miR-148b、TGFB2、SMAD2、CD31、VE-cadherin、SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1/2、VIM、FSP-1、α-SMA和COL1A1的相对表达。（C） TGFB2、p-SMAD2、SMAD2和CD31、VE-cadherin、SLUG、FSP-1和COL1A1的Western blot分析；β-actin作为负荷对照。（D）免疫荧光图像显示CD31、VE-cadherin、COL1A1和FSP-1在TNF-α/IL-1β处理细胞中的定位；比例尺，50μm（放大400倍）。数值为平均值±SEM。*p<0.05**与车辆相比，p<0.01。采用未配对双尾学生t检验。

图5
用miR-148b模拟物、SMAD2 siRNA或对照转染miR-148b-Rescures细胞因子诱导的EndMT HUVEC，并用TNF-α/IL-1β处理6天。（A） TGFB2、SMAD2、p-SMAD2 CD31、VE-cadherin、SLUG、FSP-1和COL1A1的代表性蛋白质印迹分析；HDAC3用作加载控制（n=3）。（B）免疫荧光图像显示CD31、VE-cadherin、COL1A1和FSP-1在miR-148b或对照转染的HUVECS和/或TNF-α/IL-1β治疗中的定位；比例尺，50μm（放大400×）（n=3）。（C） SMAD2、CD31、VE-cadherin、SLUG、COL1A1和FSP-1的代表性蛋白质印迹分析；HDAC3用作加载控制（n=3）。（D）免疫荧光图像显示CD31、VE-cadherin、COL1A1和FSP-1在SMAD2 siRNA或对照转染的HUVECS和/或TNF-α/IL-1β治疗中的定位；比例尺，50μm（放大400×）（n=3）。

图6
在创伤愈合模型中，对miR-148b的抑制延迟创伤闭合并启动EndMT用抗miR对照或siRNA对照寡核苷酸和抗miR-148b和/或SMAD2 siRNA治疗皮肤创伤7天。（A）左，受伤后0天和7天治疗伤口的代表性图像；比例尺，5 mm。右，伤口闭合水平表示为伤口面积与初始伤口面积的百分比（n=8）。（B）创伤血管中CD31（绿色）和FSP-1（红色）的免疫组织化学定位；刻度条，25μm（放大630×）（n=8），细胞核用DAPI染色（蓝色）。（C）创伤血管中CD31和SLUG的免疫组织化学定位；刻度条，25μm（放大630×）（n=8），细胞核用DAPI染色（蓝色）。（D）创伤中CD31/FSP-1双阳性血管、FSP-1阳性细胞和CD31/SLUG双阳性血管的定量分析；n=每组8个。数值表示为平均值±SEM。*p<0.05**与抗miR对照组相比p＜0.01。^#与抗miR-148b相比p<0.05。采用非配对双尾Student t检验和单因素方差分析统计检验，然后进行Bonferroni事后分析。

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