Acidic domain of WRNp is critical for autophagy and up-regulates age associated proteins

doi:10.1016/j.dnarep.2018.05.003

.2018年8月：68:1-11。

doi:10.1016/j.dnarep.2018.05.003。 Epub 2018年5月18日。

WRNp的酸性域对自噬和上调年龄相关蛋白至关重要

Jyotirindra Maity公司¹, Biswadip Das公司¹, 维尔姆·A·波尔², Parimal Karmakar公司^三

附属公司

¹印度加尔各答贾达夫普尔大学生命科学与生物技术系，邮编700032。
²美国马里兰州巴尔的摩国立卫生研究院国家老龄研究所分子老年学实验室，邮编21224。
^三印度加尔各答贾达夫普尔大学生命科学与生物技术系，邮编：700032。电子地址：parimal.karmakar@jadavpuruniversity.in。

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WRNp的酸性域对自噬和上调年龄相关蛋白至关重要

Jyotirindra Maity公司等。 DNA修复（Amst）. 2018年8月.

.2018年8月：68:1-11。

doi:10.1016/j.dnarep.2018.05.003。 Epub 2018年5月18日。

作者

Jyotirindra Maity公司¹, Biswadip Das公司¹, 维尔姆·A·波尔², Parimal Karmakar公司^三

附属公司

¹印度加尔各答贾达夫普尔大学生命科学与生物技术系，邮编700032。
²美国马里兰州巴尔的摩国立卫生研究院国家老龄研究所分子老年学实验室，邮编21224。
^三印度加尔各答贾达夫普尔大学生命科学与生物技术系，邮编700032。电子地址：parimal.karmakar@jadavpuruniversity.in。

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摘要

自噬受损可能与正常和病理衰老有关。在这里，我们探讨了自噬与沃纳蛋白（WRNp）结构域功能之间的联系。与临床上未受影响的GM00637和正常年轻成纤维细胞GM03440相比，沃纳（WRN）突变细胞系AG11395、AG05229和正常老年成纤维细胞AG13129对衣霉素介导的内质网（ER）应激诱导的自噬反应不足。细胞内质网（ER）应激介导的WS和正常衰老细胞的自噬在野生型全长WRN转染后恢复，但野生型WRN酸性结构域的缺失无法恢复自噬。WRNp的酸性结构域被证明调节其转录活性，在这里，我们表明它影响参与自噬和衰老的某些蛋白质的转录。此外，siRNA介导的正常成纤维细胞WI-38中WRN的沉默导致年龄相关蛋白Lamin A/C和Mre11的减少。

关键词：酸性域；老化；自噬；贝克林-1；内质网；RecQ解旋酶；沃纳蛋白；沃纳综合征。

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数字

**图1。**
用内质网应激诱导剂衣霉素处理正常成纤维细胞（GM00637）和沃纳综合征成纤维细胞细胞（AG11395）。对照细胞用完全培养基培养。（A）所有细胞在2–24小时不同时间点MDC染色的图形表示。对每种情况下的600多个细胞进行了分析。（B）正常成纤维细胞GM00637和WS细胞AG11395自噬标记蛋白的总细胞提取物的免疫印迹。（C）两种细胞系的LC3BII和LC3BI比率的图形表示。（D）两种细胞系的Beclin-1和Actin比率的图示。（E）两种细胞系比率Atg5和Actin的图示。使用3组不同实验中的3个western blot。

**图2。**
（A）用空载体（EGFPC1）或全长WRN质粒转染AG11395细胞，进行内质网应激8h。用抗LC3B、抗Beclin-1、抗Atg5抗体免疫印迹总细胞裂解物。这里使用β-肌动蛋白作为负荷控制。测量了（B–D）带强度，并用图形表示不同时间点的LC3B-II和LC3B-I、Beclin-1和Atg5的比值。（E）用全长WRN质粒转染AG05229细胞，并进行内质网应激8小时。用抗LC3B、抗Beclin-1、抗Atg5抗体免疫印迹总细胞裂解物。这里使用β-肌动蛋白作为负荷控制。（F）以图形表示LC3B-II和LC3B-I的比率。用pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3 B和ER转染正常（GM00637）和WS（AG11395）细胞，并对其进行8小时的应激处理。（G）在荧光显微镜下观察到mCherry和EGFP信号。对至少450个细胞进行了不同条件下的检查。（H）所有细胞系自噬流量的图形表示。使用了来自3组独立样本的3个western blot。***p<0.0005，平均值±标准偏差，n=3。

**图3。**
示意图表示本研究中使用的野生型WRN和不同点和缺失突变体WRN。

**图4。**
将不同WRN突变体或片段WRN或全长WRN转染AG11395细胞，然后用衣霉素和完整培养基处理细胞8h。（A）细胞总提取物的自噬标记蛋白免疫印迹。（B）所有条件下比率LC3BII和LC3BI的图形表示。使用3组不同样本的3个western blot。

**图5。**
AG11395和GM00637细胞系用内质网应激源膜霉素和完全培养基处理8小时。（A）自噬通量标记蛋白p62的总细胞提取物免疫印迹。（B） p62和肌动蛋白比值的图示。（C）将野生型WRN和WRNΔAcidic转染AG11395细胞。用抗p62抗体对全细胞裂解液进行免疫印迹。（D） p62和肌动蛋白比例的图示。这里使用β-肌动蛋白作为负荷控制。使用3组不同样本的3个western blot。

**图6。**
未受影响的正常青年（GM03440）和老年（AG13129）成纤维细胞用ER应激源衣霉素和完全培养基处理8h。（A）用抗LC3B、抗Beclin-1、抗Atg5抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹。这里使用β-肌动蛋白作为负荷控制。（B）测量条带强度，并用图形表示LC3B-II和LC3B-I的比率p<0.0005，平均值±标准偏差，n=3。

**图7。**
将野生型WRN和WRN A酸性转染AG11395细胞。用抗拉明、抗H3.3B、抗Mre11、抗NF-κB和抗CDC2等不同蛋白免疫印迹全细胞提取物。这里使用ß-肌动蛋白作为负载控制。（B-F）分别表示拉明A、组蛋白3.3B、Mre11、NFkB和CDC2与肌动蛋白的比率。每种情况检查3个western blot。*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005平均值±标准偏差，n=3。

**图8。**
将野生型WRN和WRNΔAcidic（A和D）转染正常成纤维细胞GM00637和WI-38细胞。用抗拉明、抗Mre11等不同蛋白对全细胞提取物进行免疫印迹，以β-肌动蛋白作为负荷对照。（B–C）表示拉明A和Mre11比率的图形表示。（E）表示WI-38细胞中拉明A比率的图形表示。

**图9。**
（A）在Wi-38细胞中使用WRN siRNA沉默WRN蛋白。（A） Western blot分析siWRN和干扰siRNA转染细胞中WRN蛋白的表达。（B） WRN蛋白抑制的图形表示。**p<0.005，平均值±标准偏差，n=3。（C）用siWRN或干扰siRNA WI-38细胞转染后，允许其在完全培养基中生长24小时。使用抗Lamin A/C、抗Mre11抗体对总细胞裂解物进行Western blot。这里使用β-肌动蛋白作为负荷控制。（D–E）使用图像J.**p<0.005，平均值±SD，n=3对谱带强度进行量化。

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