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.2018年9月：114:1-13。
doi:10.1016/j.bone.2018.05.025。 Epub 2018年5月23日。

增强破骨细胞前血小板衍生生长因子BB型保护H型血管和成骨细胞减轻生长期小鼠糖皮质激素诱导的骨质疏松

平阳 1, 山绿 2, Yan Wang（王燕） 三, 易鹏 4, 紫星叶 5, 朱英霞 6, 郭贤鼎 7, 徐曹 8, 珍妮特·克莱恩 9
附属公司

增强破骨细胞前血小板衍生生长因子BB型保护H型血管和成骨细胞减轻生长期小鼠糖皮质激素诱导的骨质疏松

平阳等。 骨骼. 2018年9月.

摘要

儿童期慢性病的生存通常是通过使用糖皮质激素来实现的，但也伴随着显著的副作用，包括糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO）。对新闻局机制的了解仅限于成人骨骼。我们探讨了组织蛋白酶K（Ctsk）作为年轻GIO小鼠模型潜在治疗靶点的遗传丢失和抑制作用，因为组织蛋白酶K的遗传丢失会导致轻微的骨质疏松症，继发于破骨细胞骨吸收受损并维持骨形成。我们首先对Ctsk的颞骨破骨细胞和成骨祖细胞进行了特征分析-/-和野生型（WT）小鼠在原发性和继发性海绵体内分别作为小梁骨建模和重塑的代表部位。在初级海绵体中，Ctsk-/-与WT窝友相比，小鼠在幼年（2周和4周）时破骨细胞数量减少，在晚年（8周）时成骨细胞谱系细胞增加。在次生海绵体内，Ctsk-/-与WT窝友相比，小鼠破骨细胞和成骨细胞谱系细胞数量更多。接下来，我们用10 mg/m的泼尼松龙开发了一个年轻的GIO小鼠模型2/从2周龄到6周龄每天腹腔注射一次。总的来说，WT-prednisolone小鼠的每组织骨体积较低，而Ctsk小鼠-/--与Ctsk相比，泼尼松龙小鼠保持了相似的骨体积-/--车辆控制。与WT-vehicle小鼠相比，WT-prednisolone小鼠在原发性和继发性海绵体内的破骨细胞、抗酒石酸磷酸酶和血小板衍生生长因子BB型（PDGF-BB）共阳性细胞、H型内皮细胞和成骨细胞数量均减少。有趣的是，Ctsk-/--泼尼松龙小鼠表现出一种反常反应，原发性海绵体的所有参数均增加，而继发性海绵体无变化。最后，用组织蛋白酶K抑制剂治疗可防止破骨细胞、成骨细胞、H型血管和骨体积的WT-prednisolone下降。这些数据表明，原发性和继发性海绵体内的细胞对糖皮质激素和基因操纵的反应不同。通过抑制组织蛋白酶K等途径抑制破骨细胞再吸收，从而保留破骨细胞偶联因子，可能是一种潜在的预防性治疗策略，可预防生长骨骼中的GIO。

关键词：骨血管；糖皮质激素性骨质疏松症；老鼠；产后发育。

PubMed免责声明

利益冲突声明

披露

所有作者都表示，他们没有利益冲突。

数字

图1。
图1.组织蛋白酶K表达的缺失在小鼠青春期晚期之前不会显著改变原发性海绵体内的成骨细胞谱系细胞或骨体积。
(A-D公司)代表性抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色（粉红色）(A类)和Osterix（Osx）染色（棕色）图像(C类)胫骨原发性海绵体破骨细胞数量/小梁骨面积的定量分析（N.Oc/Tb.Ar）(B类)和每个小梁骨面积的Osx阳性细胞（Osx+细胞/Tb。氩）(天)WT和Ctsk公司−/−老鼠。黑色箭头指向Osterix+细胞。(E类)2周、4周和8周龄原发性海绵体胫骨松质骨每组织面积（Tb.Ar/T.Ar）的定量分析Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−老鼠。苏木精复染细胞核呈紫色。比例尺，50μm。n=每组3个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图2。
图2继发性海绵状成骨细胞谱系细胞和骨体积在出生后的整个生长期都增加Ctsk公司−/−老鼠。
(A-D公司)代表性抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色（粉红色）(A类)和Osterix（Osx）染色（棕色）图像(C类)胫骨继发性海绵状骨中每小梁面积破骨细胞数量的定量分析（N.Oc/Tb.Ar）(B类)和每个小梁骨面积的Osx阳性细胞（Osx+细胞/Tb。氩）(天)WT和Ctsk公司−/−老鼠。黑色箭头指向Osterix+细胞。(E类)2周龄、4周龄和8周龄胫骨继发性海绵体松质骨小梁面积/组织面积（Tb.Ar/T.Ar）的定量分析Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−老鼠。苏木精复染细胞核呈紫色。比例尺，50μm。n=每组3个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3。
图3.删除Ctsk公司预防泼尼松龙相关的骨质流失
（A）6周龄儿童股骨远端典型微机断层扫描结果Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−小鼠注射溶媒（veh）或泼尼松龙10mg/m2/天（pred）持续4周。（B-E）每组织体积小梁骨体积的定量分析（BV/TV）（B），小梁数（Tb.N）（C），小梁分离（Tb.Sp）（D）和小梁厚度（Tb.Th）（E）WT和Ctsk公司−/−小鼠注射载体或泼尼松龙。n=每组6个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4。
图4..陷阱+单元格增加Ctsk公司−/−无论小鼠是否暴露于载体或泼尼松龙。
(A-B公司)代表性抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色（粉红色）图像和TRAP阳性细胞数量的定量分析+)股骨初级（A）和次生海绵状体（B）6周大Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−小鼠注射溶媒（veh）或泼尼松龙10mg/m2/天（pred）持续4周。苏木精复染细胞核呈紫色。比例尺，20μm。n=每组6个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01。
图5。
图5.PDGF-BB增加Ctsk公司−/−泼尼松龙暴露小鼠。
(A-B公司)血小板衍生生长因子BB型（PDGF-BB）（绿色）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（红色）免疫荧光染色的代表性图像，以及PDGF-BB数量的量化+捕集器+股骨原代细胞（黄色）（A）和继发性海绵体（B）6周大Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−小鼠注射溶媒（veh）或泼尼松龙10mg/m2/天（pred）持续4周。DAPI将细胞核染成蓝色。比例尺，50μm。（C）ELISA分析骨髓PDGF-BB浓度。n=每组6个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图6。
图6.H型内皮细胞CD31你好Emcn公司你好野生型细胞减少，但保持在Ctsk公司−/−泼尼松龙暴露小鼠。
(A类)CD31的CD31（红色）和内黏蛋白（Emcn）（绿色）免疫染色的代表性图像你好Emcn公司你好6周龄大鼠股骨远端干骺端（黄色）细胞Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−小鼠注射溶媒（veh）或泼尼松龙10mg/m2/天（pred）持续4周。红色方框通过放大一级（顶部面板）和二级（底部面板）海绵体勾勒出感兴趣的区域。DAPI将细胞核染成蓝色。比例尺，50μm。（B-C）CD31的量化你好Emcn公司你好每毫米（黄色）单元格2初级(B类)和继发性海绵体(C类). n=每组6个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7。
图7：成骨细胞在原发性海绵体内增加，在继发性海绵中维持Ctsk公司−/−泼尼松龙暴露小鼠
典型的骨钙素染色（棕色）图像和骨钙素阳性细胞（OCN）数量的定量分析+)股骨初级（A）和继发性海绵体（B）6周大Ctsk公司+/+野生型（WT）和Ctsk公司−/−小鼠注射溶媒（veh）或泼尼松龙10mg/m2/天（pred）持续4周。苏木精复染细胞核呈紫色。比例尺，50μm。n=每组6个。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01。
图8。
图8.L-235保护骨骼免受糖皮质激素诱导的骨丢失
(A-B公司)代表性抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）（品红）(A类)以及每毫米阳性染色细胞数量的量化2(B类)在注射泼尼松龙10mg/m的6周龄野生型小鼠股骨远端原发性海绵细胞瘤中2/天（Pred），或泼尼松龙加组织蛋白酶K抑制剂L-235，每天20 mg/kg（Pred+L-235），持续4周。陷阱用托洛定蓝复染。比例尺，50μm。(C-D公司)免疫荧光染色(C类)Trap（红色）和血小板衍生生长因子BB型（PDGF-BB）（绿色）的数量，以及Trap数量的量化+PDGF-BB公司+单元格（黄色）(天). DAPI将细胞核染成蓝色。比例尺，100μm。(E-F公司)免疫荧光染色(E类)和量化(F类)CD31（红色）和内切粘蛋白（Emcn）（绿色），每平方毫米血管表面定量。共染色细胞呈黄色。比例尺，100μm。n=每组6个。(G-H公司)Osterix（Osx）免疫组织化学染色（细胞核染色棕色）(G公司)以及每毫米阳性染色细胞数量的量化2(H（H）). 苏木精复染。比例尺，20μm。（I-J）代表性微机断层扫描(我)和定量分析(J型)骨体积与组织体积的比值（BV/TV）。比例尺，1 mm。每组6个。数据显示为相对于车辆的平均值±标准差*P<0.05，**P<0.01。#P<0.05，##P<0.01，###相对于Pred，P<0.001。
图9。
图9 PDGF-BB通过VEGF信号增强泼尼松龙对内皮管形成的抑制
(A-B公司)代表性Matrigel试管形成分析图像(A类)和量化(B类)用1X PBS（对照）培养的内皮前体细胞（EPCs）的管长，单独60 ng/mL PDGF-BB，10−6单用M泼尼松龙（Pred）或PDGFF-BB加泼尼松隆治疗4小时。比例尺，200μm。(B类)通过从试管形成测定中收获的EPC的RT-PCR获得的所表示的mRNA的相对基因表达。实验重复了3次。数据显示为平均值±标准差*P<0.05，***P<0.001，对照组与Pred、，&P<0.05，&&与PDGF-BB相比，P<0.01##与Pred+PDGF-BB相比，对照组P<0.01。
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