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.2018年5月22日；9(6):598.
doi:10.1038/s41419-018-0641-7。

陆地棉碱通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途径诱导人肺癌细胞mPTP依赖性凋亡

张荣 1, 李国兵 1, 钱章 1, 秦唐 1, 黄景斌 1, 胡长鹏 1, 刘亚丽 1, 王庆（音） 1, 刘武义 1, 宁高 2, 周世文 三
附属公司

陆地棉碱通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途径诱导人肺癌细胞mPTP依赖性凋亡

张荣等。 细胞死亡病. .

摘要

从钩藤中提取的陆地棉具有抗癌活性。然而，陆地棉具有抗肺癌活性的分子机制尚不清楚。在本研究中，我们发现，陆地棉碱通过线粒体膜电位（∆ψm）损失、三磷酸腺苷（ATP）耗竭、ROS生成以及细胞色素c释放，诱导人肺癌细胞凋亡。GSK3β的去磷酸化通过ANT1/CypD相互作用参与多毛素介导的线粒体通透性转换孔（mPTP）的打开。机制研究表明，ROCK1/PTEN/PI3K/Akt信号通路的阻断在多毛素介导的GSK3β去磷酸化和线粒体凋亡中起着关键作用。我们的体内研究还表明，在A549异种移植物小鼠模型中，多毛素通过ROCK1/PTEN/PI3K/Akt信号介导的GSK3β去磷酸化和细胞凋亡有效抑制肿瘤生长。总的来说，这些发现表明了一个层次模型，其中陆地棉碱诱导凋亡主要来源于ROCK1和PTEN的激活，PI3K/Akt的失活，进而导致GSK3β去磷酸化和mPTP开放，最终导致caspase-3激活和凋亡。这些发现可能为陆地棉在人类肺癌治疗中的应用提供新的机制基础。

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数字

图1
图1。陆地棉素选择性抑制人肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。
一陆地棉的化学结构。b,c（c）用不同浓度的陆地棉碱处理人正常肝细胞LO2细胞、人肺上皮成纤维细胞WI38细胞、人肺癌A549和NCI-H1299细胞12或24小时 h；细胞存活率由细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3).d日,e（电子）用不同浓度的陆地棉碱处理A549和NCI-H1299细胞24小时 h或80 不同时间间隔的μM陆地棉。采用Annexin V-FITC/PI染色通过流式细胞术测定凋亡细胞的百分比。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3). *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01与对照组相比。如果制备全细胞裂解物，并使用所示的抗裂解PARP（C-PARP）、裂解caspase 3（C-caspase 3）抗体进行western blot分析。克,小时LO2、WI38、A549和NCI-H1299细胞用80 24μM陆地棉 h、 然后用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪分析。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3), **P（P） < 0.01与用多毛苏氨酸处理的LO2细胞相比，##P（P） < 0.01 vs.用多毛松碱处理的WI-38细胞
图2
图2。陆地棉诱导A549细胞线粒体损伤。
一A549细胞用80 24μM陆地棉 h、 透射电镜观察线粒体。比例尺：1 微米。b用不同浓度的陆地棉处理A549细胞24小时 h.使用ATP测定试剂盒测定ATP浓度。c（c）,d日通过共聚焦显微镜或使用JC-1染色的微孔板读取器分析的线粒体膜电位。比例尺：20 微米。红色/绿色荧光强度的比值表示线粒体膜的电位。e（电子）DCF-DA染色检测细胞内ROS水平；流式细胞仪测定ROS荧光强度的平均值。如果制备线粒体（Mito）和细胞溶质（Cytosol）组分并进行western blot分析。使用Quantity One软件进行密度分析，将细胞溶质组分中细胞C的相对强度归一化为肌动蛋白。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3). 结果以控制百分比表示，设定为100%**P（P） < 0.01相对于对照组
图3
图3。陆地棉通过线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放诱导细胞凋亡。
一,bA549细胞用5 µM环孢菌素A（CSA，CypD抑制剂）2 h、 然后用80 24μM陆地棉 h.细胞用钙黄绿素-AM和氯化钴染色2用共聚焦激光扫描显微镜或微孔板阅读器分析线粒体中钙黄绿素荧光。比例尺：20 微米。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3). *P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01之间。c（c）细胞按照一，使用抗ANT1抗体对等量的裂解物进行免疫沉淀，使用免疫印迹法测定相关的CypD。d日细胞按照一，使用基于萤火虫荧光素酶的ATP测定试剂盒测量ATP浓度。e（电子）细胞按照一采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定凋亡细胞百分比。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3), **P（P） < 0.01
图4
图4。GSK3β抑制剂CHIR增强陆地棉素诱导的mPTP开放和凋亡。
一用不同浓度的陆地棉处理A549细胞24小时 h或80 μM陆地棉不同时间间隔；免疫印迹法检测GSK3β和p-GSK3蛋白的表达。bA549细胞用5 用于2的µM CHIR99021（CHIR，GSK3抑制剂） h、 随后用60 24μM陆地棉 h.制备全细胞裂解物并进行免疫沉淀，以确定p-GSK3β、CypD和ANT1的相互作用。c（c）按照所示进行处理后b用p-GSK3β（Alexa Fluor 647，红色）、ANT1（Alexa-Fluor 488，绿色）和DAPI染色；共聚焦显微镜采集图像。比例尺代表20 微米。d日细胞按照b微板阅读器分析线粒体钙黄绿素荧光。e（电子）细胞按照b，使用ATP测定试剂盒测定ATP浓度。如果细胞按照b采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定凋亡细胞百分比。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3), **P（P） < 0.01
图5
图5。抑制PI3K活性在陆地棉素诱导的GSK3β去磷酸化、mPTP开放和凋亡中起重要作用。
一用不同浓度的陆地棉处理A549细胞24小时 h或80 μM陆地棉不同时间间隔；制备全细胞裂解物并进行western-blot分析。bA549细胞用20 µM LY294002（一种特异性PI3K抑制剂）用于2 h、 随后用60 24μM陆地棉 h.制备全细胞裂解物并进行western blot分析。c（c）细胞按照b，通过免疫沉淀法测定p-GSK3β、CypD和ANT1的相互作用。d日细胞按照b微板阅读器分析线粒体钙黄绿素荧光。e（电子）细胞按照b，使用ATP测定试剂盒测定ATP浓度。如果细胞按照b用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-PARP和C-Caspase 3。克细胞按照b采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定凋亡细胞百分比。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3), **P（P） < 0.01
图6
图6。ROCK1/PTEN/PI3K通路调节陆地棉素介导的GSK3β去磷酸化、mPTP开放和凋亡。
一用不同浓度的陆地棉处理A549细胞24小时 h或80 μM陆地棉不同时间间隔；制备全细胞裂解物并进行western-blot分析。CF：解理片段。b,c（c）A549细胞用20 µM Y-27632（ROCK1活化抑制剂）2 h、 然后用80 24μM陆地棉 h.制备全细胞裂解物并进行western blot分析。d日细胞按照b，通过免疫沉淀法测定p-GSK3β、CypD和ANT1的相互作用。e（电子）细胞按照b微板阅读器分析线粒体钙黄绿素荧光。如果细胞按照b，使用ATP测定试剂盒测定ATP浓度。克细胞按照b用免疫印迹法测定全细胞裂解物中的C-PARP和C-Caspase 3。小时细胞按照b采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定凋亡细胞百分比。数据表示为平均值 ± 标准偏差(n个 = 3), **P（P） < 0.01
图7
图7。在A549异种移植模型中，陆地棉抑制肿瘤生长并诱导凋亡。
小鼠皮下接种A549细胞（2 × 106)分为右翼，并随机分为两组(n个 = 10). 小鼠腹腔注射10 mg/kg/天或同等体积的溶媒。一载药对照小鼠和陆地棉素治疗小鼠的肿瘤生长曲线**P（P） < 0.01与对照组相比。b两组肿瘤的代表性图像。c（c）溶媒对照组和多毛苏氨酸治疗组之间的体重没有显著差异。d日固定每组具有代表性的两个肿瘤组织，并进行苏木精和伊红（H&E）染色，以及C-CASP3和p-GSK3β（Ser9）的免疫组织化学染色。e（电子）显示了来自两组的代表性H&E染色的肝脏和肾脏切片。比例尺：25 微米。如果制备每组有代表性的两个肿瘤组织并进行western blot分析
图8
图8。陆地棉碱诱导人肺癌细胞凋亡模型。
Hirsutine诱导ROCK1分裂/活化、PTEN活化（磷酸化）和PI3K/Akt失活（去磷酸化），导致GSK3β去磷酸化，导致GSKβ和ANT1结合减少，ANT1与CypD的相互作用增加，最终导致mPTP开放、caspase活化和凋亡
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