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.2018年5月21日;9(6):579.
doi:10.1038/s41419-018-0594-x。

新型肽GX1通过特异性结合谷氨酰胺转胺酶-2抑制胃癌血管生成

附属公司

新型肽GX1通过特异性结合谷氨酰胺转胺酶-2抑制胃癌血管生成

雷志杰(Zhijie Lei)等。 细胞死亡病. .

摘要

GX1是一种理想的胃癌靶向肽,由于其在胃癌血管中的受体未知,其临床应用受到很大限制。在本研究中,我们通过免疫共沉淀(co-IP)结合质谱法筛选了GX1的候选受体转谷氨酰胺酶-2(TGM2)。我们发现TGM2在GC血管内皮细胞中上调,并且在TGM2下调后GX1受体表达相应受到抑制。在细胞和组织水平上检测到GX1受体和TGM2高度一致的共定位。预后不良患者的GC组织中TGM2明显高表达。TGM2下调后,GX1介导的GC血管内皮细胞增殖、迁移抑制和凋亡诱导作用减弱甚至逆转。最后,我们观察到GX1可以通过减少TGM2在GC血管内皮细胞中的细胞内分布并下调其下游分子靶点(核因子-κB,NF-κB;低氧诱导因子1-α,HIF1α)来抑制TGM2的GTP-结合活性。我们的研究证实,肽GX1可以通过直接与TGM2结合来抑制血管生成,随后降低TGM2的GTP结合活性,从而抑制其下游通路(NF-κB/HIF1α)。我们的结论提示GX1/TGM2可能为GC的诊断和治疗提供一个新的靶点。

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利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。检测联合人脐静脉内皮细胞中GX1受体的表达以及GX1对联合人脐血内皮细胞迁移的影响。
在联合HUVEC裂解物与不同浓度的生物素GX1和生物素URP(0.2、0.1、0.02和0.01)孵育后mg/ml),一个特定的结合带约为70用生物素标记肽GX1通过Western blotting检测kDa(用红色箭头1、2、3和4表示)。b条HUVEC和co-HUVEC中GX1受体(红色)的免疫荧光染色。c(c)用GX1或不使用GX1预处理的co-HUVEC迁移的伤口愈合试验。照片是在放大200倍和12倍的条件下拍摄的划伤后h***P(P) < 0.001,n个 = 4d日检测GX1(0.1毫克/毫升,24h) 联合HUVEC迁移。照片以200倍的放大倍数拍摄。用ImageJ软件计算每个场的迁移细胞数*P(P) < 0.05,n个 = 4
图2
图2。联合脐静脉内皮细胞GX1受体的筛选。
,b条结合GX1的蛋白质通过联合免疫沉淀从co-HUVEC裂解物中富集,通过SDS-PAGE分离,并进行考马斯蓝染色()并与生物素GX1孵育(b条). 在大约70输入端(红色箭头2表示)和IP-GX1通道(与GX1结合的蛋白质,红色箭头1和3表示)中的kDa。IP-URP(蛋白结合URP)和Beads(蛋白结合磁珠)通道被用作阴性对照。c(c)(面板a和b)TGM2通过Q-Exactive质谱鉴定。通过Q-Exactive获得的TGM2的MS/MS光谱,结合胰酶消化斑点1后的纳米流毛细管高效液相色谱()如图所示。d日通过SDS-PAGE分离联合免疫沉淀期间与GX1结合的蛋白,然后与TGM2抗体孵育。Western blotting结果显示,在IP-GX1中检测到一条特定的条带(约100kDa,由红色箭头4)车道指示,并且在IP-URP车道的同一位置未检测到波段
图3
图3。胃癌细胞和组织中TGM2的表达及GX1受体和TGM2共同定位。
(面板a和b)来自联合HUVEC、HUVECs、SGC7901细胞和GES细胞的总蛋白裂解物与TGM2-抗体孵育并通过Western blotting进行检测*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01,n个 = 三。b条同时对胃癌组织的三个连续切片进行GX1受体、TGM2或CD31免疫组化染色分析。c(c)HUVEC和co-HUVEC中GX1-受体(绿色)和TGM2(红色)的双重免疫荧光染色。合并的图片显示GX1受体(绿色)和TGM2(红色)的重叠,细胞核用40,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,蓝色)染色
图4
图4。胃癌中TGM2表达显著上调,TGM2高表达提示预后不良。
用免疫组织化学方法检测邻近非肿瘤组织和原发性GC组织中TGM2的代表性表达。b条TGM2在原发性GC组织和邻近非肿瘤组织中表达的比较。c(c)TGM2表达与人类GC患者生存分数相关性的Kaplan-Meier分析
图5
图5。TGM2对co-HUVEC增殖、凋亡和迁移的影响。
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试验用于分析伴或不伴TGM2下调的联合HUVEC增殖**P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001,n个 = 6.伤口愈合(b条)和Transwell(d日)用siRNAs检测TGM2下调后的co-HUVEC迁移*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01; ***P(P) < 0.001,n个 = 4c(c)TGM2敲除后co-HUVEC凋亡的流式细胞术分析
图6
图6。siRNAs下调TGM2后GX1对co-HUVEC凋亡和迁移的影响。
(小组a、b、c)TGM2敲除的联合HUVEC中GX1受体和TGM2-抗体的蛋白质印迹分析*P(P) < 0.05; **P(P) < 0.01;n个 = 三。b条流式细胞术分析TGM2对GX1治疗或不治疗的凋亡co-HUVEC的抑制作用(0.1毫克/毫升,48h) ●●●●。Transwell公司(c(c))和伤口愈合(d日)测定TGM2下调后GX1介导的联合HUVECs迁移抑制的变化*P(P) < 0.05; ***P(P) < 0.001;n个 = 4
图7
图7。评估GX1对TGM2亚细胞分布、TGM2 G蛋白活性和细胞内TGM2下游分子靶点表达的影响。
经或不经GX1(0.1)处理的co-HUVEC总蛋白样品和膜蛋白样品中TGM2的Western blotting分析毫克/毫升,24h) 当TGM2表达下调时**P(P) < 0.01;n个 = 三。b条GX1(0.1毫克/毫升,24h) 免疫荧光对TGM2在co-HUVEC亚细胞分布的影响。c(c)GX1(0.1毫克/毫升,24h) 免疫电子显微镜对TGM2在co-HUVEC中亚细胞分布的影响(a-1代表a的示意图;b-1代表b的示意图)。对照组中的TGM2分布用蓝色箭头表示。用红色箭头表示经GX1处理的co-HUVEC中TGM2的分布。d日经GX1(0.1)处理的co-HUVEC中TGM2的GTP-结合活性的改变毫克/毫升,24h) ●●●●。e(电子)GX1(0.1毫克/毫升,24h) 对co-HUVEC中NF-κB和HIF1αmRNA表达的影响***P(P) < 0.001;n个 = 三。(f)GX1(0.1毫克/毫升,24h) 在co-HUVEC蛋白水平上对NF-κB和HIF1α表达的影响*P(P) < 0.05;n个 = 三。GX1抑制胃癌血管生成机制的示意图

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