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.2018年5月21日；14（5）：e1007085。
doi:10.1371/journal.ppat.1007085。 eCollection 2018年5月。

核心蛋白连接子在乙型肝炎病毒复制中的多重作用

刘宽城 1 2, 劳丽·勒肯鲍 1, 宁小军 1, 季曦 1, 胡建明 1
附属公司

核心蛋白连接子在乙型肝炎病毒复制中的多重作用

刘宽城等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）包含一个N末端结构域（NTD，组装结构域）和一个C末端结构域，它们通过一个柔性连接子区域连接。HBc在病毒复制中发挥着多种重要作用，包括衣壳组装、将病毒前基因组RNA（pgRNA）包装成核衣壳、将pgRNA转化为基因组DNA的病毒逆转录以及分泌含DNA（完整）病毒或无基因组（空）病毒。HBc连接体通常被认为仅作为NTD和CTD之间的间隔物，但一些结果表明连接体可能影响NTD组装。为了确定其在病毒复制中的作用，我们在存在或不存在CTD的情况下，在连接子区域制造了许多缺失和替换突变体，并测试了它们支持衣壳组装和人类细胞中病毒复制的能力。我们的结果表明，在没有CTD的情况下，连接子确实可以阻碍NTD的组装，部分连接子的缺失可以部分缓解这一问题。相反，当CTD存在时，连接子缺失或取代不影响衣壳组装。整个连接子或其C末端部分的缺失导致pgRNA包装的部分缺陷，并严重损害病毒DNA合成。相反，连接子N末端的缺失或连接子序列的替换对RNA包装或第一链DNA合成几乎没有影响。然而，N末端连接子缺失和两个连接子替换突变体在生产成熟的双链病毒DNA时存在缺陷。所有被测试的连接子缺失和替换都阻止了空病毒的分泌。特别是，允许成熟病毒DNA合成和分泌完整病毒粒子的保守连接子替换严重损害了空病毒粒子的分泌，从而增加了分泌的完全病毒粒子与空病毒粒子之比。总之，这些结果表明HBc连接区在HBV复制的多个阶段起着关键和复杂的作用。

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数字

图1
图1。HBc连接子缺失和替换对病毒复制不同步骤的影响。左侧。
WT-HBc的示意图（顶行；上标所示的连接序列），以及不同的缺失和替换突变体。对于截断（全部来自C末端），突变蛋白的最后位置包含在结构体的名称中（例如，HBc149结束于149位）；对于内部缺失，被移除的残基在突变体的名称中指示（例如，Δ141–149移除整个连接子）；对于取代，突变连接子序列显示在上标中，与WT不同的残基用红色突出显示。NTD、连接子和CTD边界显示在顶部。正确的。不同HBc突变对衣壳组装（Ca assem）、pgRNA包装（RNA pack）、DNA合成（DNA synth）、病毒粒子DNA（V-DNA；分泌完整病毒粒子）和病毒粒子衣壳（V-Ca；分泌空病毒粒子）的影响，重量的50–100%；++，重量的10–50%；+，重量的1–10%；+/-，小于重量的1%；-，无法检测（通过DNA的Southern blot分析）。对于装配缺陷突变体（即，那些缺乏整个CTD和部分或全部连接子的突变体），其表达水平也低于WT的表达水平（有关对蛋白质生产和/或降解的可能影响的讨论，请参阅正文）。
图2
图2。在没有CTD的情况下，通过HBc连接子缺失突变体分析HBV衣壳组装和病毒分泌。
HepG2（A和B）或Huh7细胞（C和D）转染指定的HBc表达结构，以及HBc表达缺陷的HBV基因组结构。七天后，收集培养上清和细胞。A和C。在琼脂糖凝胶电泳后，使用兔抗HBc多克隆抗体（2第面板）和使用反义HBV RNA探针的pgRNA包装（顶部）。在SDS-PAGE和转移到PVDF膜后，使用小鼠单克隆抗体T2221（3第个面板）。通过preS2特异性mAb检测HBV L和M包膜蛋白的水平，以监测转染效率和样品装载量（底部）。B和D浓缩培养上清液（培养基）通过琼脂糖凝胶电泳分析病毒分泌。转移到硝化纤维素膜后，使用HBV DNA探针（B和D，左上角）检测释放到培养基中的病毒（和裸衣壳）中的HBV DNA，并使用兔抗HBc多克隆抗体（B和B，右上角）进行衣壳蛋白的western blot分析。使用兔抗-HBs抗体（B和D，底部）检测HBV包膜蛋白。在面板D中，加载WT HBc转染产生的减少量的上清液（1–3、7–9道），通道1和7中的加载量等于突变HBc140（C140，4、10道）和HBc143（C143，5、11道）转染以及通道2、3、8中加载的加载量，与车道1和7中的荷载相比，9分别减少了5倍和10倍。装载在泳道6和12中的样品来自仅用HBc缺陷基因组构建体转染而没有HBc表达构建体的细胞。五、 病毒粒子；Ca，衣壳；C、 HBc；C类T型，截断HBc（HBc140、HBc143、HBc149）。
图3
图3。在CTD存在的情况下，通过HBc连接子缺失突变体分析HBV衣壳组装和病毒分泌。
HepG2（A和B）或Huh7细胞（C和D）转染指定的HBc表达结构，可以单独转染（B和D，1–3区），也可以与HBc表达缺陷的HBV基因组结构一起转染（A和C，所有区；B和D区，4–6区）。七天后，收集培养上清和细胞。A和C。在琼脂糖凝胶电泳并转移到硝酸纤维素膜后，对细胞质裂解产物进行分析，以使用兔抗-HBc多克隆抗体（中间）进行衣壳组装，并使用反义HBV RNA探针包装pgRNA（顶部）。使用小鼠单克隆抗体T2221（底部），在SDS-PAGE和转移到PVDF膜后，测量总HBc水平。B和D浓缩培养上清液（培养基）通过琼脂糖凝胶电泳分析病毒分泌。转移到硝化纤维素膜后，使用HBV DNA探针（顶部）和衣壳蛋白（底部）检测释放到培养基中的病毒（和裸衣壳）中的HBV DNA。五、 病毒粒子；Ca，衣壳；C、 HBc.*，转染HBc/Δ141-149的Huh7细胞上清液中HBc信号迁移速度慢于裸衣壳(D类).
图4
图4。HBc连接子替换和缺失突变体对HBV衣壳组装和病毒分泌的分析。
HepG2（A和B）或Huh7细胞（C和D）转染指定的HBc表达结构，以及HBc表达缺陷的HBV基因组结构。七天后，收集培养上清和细胞。A和C。在琼脂糖凝胶电泳并转移到硝酸纤维素膜后，对细胞质裂解产物进行分析，以使用兔抗-HBc多克隆抗体（中间）进行衣壳组装，并使用反义HBV RNA探针包装pgRNA（顶部）。使用小鼠单克隆抗体T2221（底部），在SDS-PAGE和转移到PVDF膜后，测量总HBc水平。B和D.分析浓缩培养上清（培养基）的病毒分泌情况。琼脂糖凝胶电泳后转移到硝化纤维素膜上，用HBV DNA探针（顶部）和衣壳蛋白（底部）检测释放到培养基中的病毒（和裸衣壳）中的HBV DNA。五、 病毒粒子；Ca，衣壳；C、 HBc公司。
图5
图5。HBc连接子缺失和取代突变体合成HBV DNA的分析。
HepG2细胞转染了指定的HBc表达结构，以及HBc表达缺陷的HBV基因组结构。七天后，收集转染细胞。从细胞质裂解物中提取HBV NC相关DNA（核心DNA）（无核酸酶消化，详见材料和方法），并通过Southern印迹分析进行检测。在Southern blot分析之前，通过DpnI消化去除输入质粒DNA（但不是病毒复制DNA）。RC，RC DNA，；SS，SS DNA。
图6
图6。用HBc149-4R分析衣壳组装和病毒分泌。
将WT HBc或HBc149-4R的表达构建物与HBc表达缺陷的HBV基因组构建物（C-)以指示的比例（微克数量；每皿DNA总量保持在10微克）。七天后，收集培养上清和细胞。A和B。在琼脂糖凝胶电泳后，使用兔抗HBc多克隆抗体将细胞质裂解产物转移到硝酸纤维素膜上，分析衣壳组装(B类)以及使用反义HBV RNA探针包装pgRNA(A类).C-E公司.分析浓缩培养上清（培养基）的病毒分泌情况。在琼脂糖凝胶电泳并转移到硝酸纤维素膜后，使用HBV DNA探针检测释放到培养基中的病毒粒子和裸衣壳中的HBV DNA(C类)用兔抗HBc多克隆抗体检测衣壳蛋白(D类)和抗HBs抗体的包膜蛋白(E类). 7–12车道代表1–6英寸车道的较短曝光时间D类.V，病毒粒子；Ca，衣壳。
图7
图7。HBc连接子突变体对RRL体外翻译系统中CTD磷酸化状态的影响。
在RRL中翻译WT HBc或连接子缺失和替换突变体。翻译的WT和突变HBc蛋白（3–9道），以及模拟翻译（2道；翻译过程中未添加模板DNA）和从大肠杆菌纯化的HBc蛋白质（1道），通过SDS-PAGE进行解析，然后通过western blot分析进行检测，使用NTD-specific mAb T2221（顶面板）和两个CTD-specified mAb B701（中面板）和25–7（底面板）。B701信号和25-7信号被量化并归一化为相应的T2221信号（B701:T2221或25-7:T2221）。与WT HBc相比，缺失或替代HBc突变体的标准化B701或25-7信号（设置为1.00）列在底部。C、 HBc公司。
图8
图8。HBc连接子在HBV复制多个阶段的功能的工作模型。
该接头被认为通过NTD对衣壳组装发挥作用，通过CTD对pgRNA包装和DNA合成发挥作用，通过与包膜蛋白的相互作用对病毒粒子分泌发挥作用。衣壳用六边形表示，病毒包膜用圆圈表示，pgRNA用波浪线表示，SS DNA用直线表示，RC DNA用断裂的双同心圆表示，箭头指向正链的3'端。包含RC DNA（即成熟）NC的折线表示成熟NC不稳定。红线表示抑制或负面影响；绿线、刺激或积极。还指出了负效应和正效应的假定介体，包括构象-参与组装的NTD或CTD构象或HBc功能的其他指示方面；推测的宿主因子（HF）调节衣壳组装；控制CTD磷酸化状态的宿主蛋白激酶或蛋白磷酸酶（PPase）。病毒粒子分泌过程中HBc连接子和包膜蛋白之间的假定相互作用也用绿线表示。seq，序列；（in）依赖，（in）从属；*，空病毒的分泌是连接子最具序列特异性的功能。详见正文。
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    1. 胡J（2016）《乙型肝炎病毒病毒学与复制》收录：Liaw Y-F，Zoulim F，编辑。人类疾病中的乙型肝炎病毒。施普林格·查姆·海德堡（Springer Cham Heidelberg），纽约多德雷赫特（Dordrecht），伦敦：人文出版社；第1-34页。
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