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.2018;10(3):517.
doi:10.4172/1948-5956.1000517。 Epub 2018年3月22日。

Separase抑制剂Sepin-1抑制Foxm1表达和乳腺癌细胞生长

张能刚 1, 黛巴南达·帕蒂 1
附属公司

Separase抑制剂Sepin-1抑制Foxm1表达和乳腺癌细胞生长

张能刚等。 癌症科学与治疗杂志. 2018.

摘要

Sepin-1是一种有效的非竞争性分离酶抑制剂，可抑制癌细胞生长，但Sepin-1介导的生长抑制机制尚不完全清楚。在这里，我们报道了Sepin-1阻碍乳腺癌细胞的生长、细胞迁移和伤口愈合。Sepin-1对细胞生长的抑制作用在体外似乎不是通过凋亡，而是由于生长抑制。Sepin-1治疗后，caspase 3和7未被激活，Poly（ADP-核糖）聚合酶（Parp）未被裂解。转录因子Forkhead box蛋白M1（FoxM1）及其靶基因在细胞周期中的表达，包括Plk1、Cdk1、Aurora a和Lamin B1，以Sepin-1依赖性方式减少。用Sepin-1治疗后，Raf激酶家族成员A-Raf、B-Raf和C-Raf的表达也受到抑制。Raf是磷酸化FoxM1的Raf-Mek-Erk信号通路中的中介物。激活的FoxM1可以通过正反馈环促进自身转录。Sepin-1诱导的Raf和FoxM1下调可能会抑制细胞周期驱动基因的表达，从而抑制细胞生长。

关键词：乳腺癌；细胞增殖；福克斯M1；拉夫；分离酶；9月1日。

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数字

图1
图1
Sepin-1抑制乳腺癌细胞的生长。将乳腺癌细胞株接种到96个培养板上过夜，并用不同浓度的Sepin-1处理3天。使用CellTiter-Blue®试剂测定细胞活力。进行了三个独立的实验。（A） ●●●●。乳腺癌细胞活性曲线。（B） ●●●●。抑制50%细胞的Sepin-1浓度。（n=3±SD）。（C） ●●●●。在制备蛋白质样品之前，将乳腺癌细胞电镀并用Sepin-1处理24小时。进行免疫印迹并用指示的抗体进行探测。
图2
图2
Sepin-1抑制三阴性乳腺癌细胞的细胞迁移。MD-MB-231或MD-MB-468细胞接种在Transwell中的滤膜顶部®插入，将含有或不含Sepin-1的培养基添加到24孔板中的下室底部。培养24小时后，去除未迁移的细胞。Transwell膜另一侧的细胞®插入物固定并用结晶紫染色。计数迁移的细胞（紫色）。迁移细胞的代表性图像如A所示。通过膜迁移的细胞百分比如B所示。该试验一式三份（n=3±SD）。***表示p<0.05。
图3
图3
Sepin-1抑制MDA-MB-468细胞的伤口愈合。MD-MB-468细胞生长在12孔板上，并形成一条直线。仔细抽吸培养基以清除细胞碎片，并用含有或不含Sepin-1的培养基替换。为了检查伤口闭合情况，在伤口形成后0、24、48和72小时拍摄图像。使用标尺测量伤口间隙的距离，如（a）所示，并带有红线。迁移细胞的代表性图像如A所示。伤口间隙闭合百分比如（B）所示。试验一式三份（n=3±SD）。***表示p<0.05。
图4
图4
Sepin-1治疗后乳腺癌细胞的TUNEL检测。将细胞接种到6孔板上，并用0、20和40μM的Sepin-1处理24小时。分离细胞并将其胞浆制成玻片。样品被固定、渗透，并用DeadEnd标记™荧光TUNEL系统（Promega）。从七个随机区域采集图像，计数TUNEL阳性细胞，并计算BT-474（A，B）和MCF7（C，D）的百分比。在MDA-MB-231（E）和MDA-MB-468（F）中几乎没有发现TUNLE阳性细胞。***表示p<0.05。比例尺，10μm。
图5
图5
Sepin-1抑制乳腺癌细胞的生长，但不通过细胞凋亡。（A） ●●●●。用Spein-1处理乳腺癌细胞24小时。制备蛋白质样品并用于反相蛋白质阵列（RPPA）分析。***结果经免疫印迹证实。（B） ●●●●。在制备蛋白质样品之前，对乳腺癌细胞进行电镀，并用含有或不含足叶乙甙的Sepin-1处理24小时。用指示的抗体进行免疫印迹。MCF7不含半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。Fl，全长；Cl，劈开；Pro，酶原；箭头，未知劈开产品。
图6
图6
Sepin-1降低FoxM1的表达。用Spein-1处理乳腺癌细胞24小时。制备蛋白质样品并用于RPPA（A，D）和免疫印迹（C，F）。制备总RNA并用于qPCR（B，E）。对免疫印迹和qPCR进行了三个独立的实验。显示了一种典型的免疫印迹法。qPCR结果为三个实验的平均值（n=3±SE）。
图7
图7
Spein-1降低细胞周期驱动蛋白的水平。在制作蛋白样品并用于RPPA（A，B）和免疫印迹（C）之前，用Spein-1处理乳腺癌细胞24小时。Plk1和Cdk1的A-B.RPPA分析。C.Plk1、中心蛋白、极光A、Cdk1和层粘连蛋白B1的免疫印迹。GAPDH和肌动蛋白作为负载对照。
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