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.2018年4月20日；9(30):20953-20964.
doi:10.18632/noctarget.25104。

DHX9调节乙型肝炎病毒衍生环状RNA的产生和病毒蛋白水平

卡祖马·塞基巴 1, 大冢本彦 1, 莫托科Ohno 1, 木川高弘 1, 马里·雅马加米 1, 铃木纹身 1, Rei Ishibashi先生 1, Takahiro Seimiya公司 1, 田中惠理 1, 小池和彦 1
附属公司

DHX9调节乙型肝炎病毒衍生环状RNA的产生和病毒蛋白水平

卡祖马·塞基巴等。 Oncotarget公司. .

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球主要的健康问题，可导致肝硬化和肝细胞癌。虽然目前的核苷类似物在临床上有效抑制病毒逆转录和病毒DNA载量，但从长期来看，病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）小染色体和cccDNA转录物仍在继续表达。我们假设，在这些条件下，病毒转录物可能具有与发病有关的生物学功能。在这里，我们表明宿主蛋白DExH-box解旋酶9（DXH9）与病毒RNA相关。我们还发现，HBV复制过程中会产生病毒衍生的环状RNA，DHX9蛋白的敲除会增加其数量，从而导致病毒蛋白水平降低，但不会影响HBV DNA水平。这些现象在HBV产生细胞培养模型和模拟HBV cccDNA的HBV小圆模型以及感染HBV的人原代肝细胞中观察到。基于这些结果，我们得出结论，在HBV感染中，RNA结合因子DHX9是病毒循环RNA和病毒蛋白水平的新调节器。

关键词：乙型肝炎病毒；免疫学；cccDNA；数字PCR；微型圆环；原代肝细胞。

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利益冲突声明

利益冲突作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1。DExH-box解旋酶9（DHX9）敲除下调病毒蛋白水平
(A类)DHX9与HBV RNA共沉淀。将每个区域（S、X和Core）对应的RNA与HepG2细胞裂解物混合在体外并沉淀。用抗DHX9印迹共沉淀蛋白。5%的细胞裂解物用作输入。NC：阴性对照（无RNA）。显示了两个独立实验的代表性图像。(B类)使用具有乙型肝炎病毒（HBV）表达的HepAD38细胞进行指示蛋白的免疫沉淀。免疫印迹法用于确认靶蛋白的免疫沉淀。5%的细胞裂解物用作输入。免疫沉淀采用正常兔IgG作为阴性对照。显示了两个独立实验的代表性图像。(C类)通过指示的蛋白质从沉淀剂中提取RNA，并进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），以确定是否包括指示的RNA区域（S、X、Core）。显示了两个独立实验的代表性图像。(D类)使用稳定表达短发夹RNA（shRNAs）的HepAD38细胞来检测HBV S蛋白的表达水平。在检测之前，向细胞中添加强力霉素（1.0μg/ml）3天，以关闭新合成的HBV转录物。将连续使用（关）或不使用（开）多西环素处理的HepAD38细胞作为对照。显示了两个独立实验的代表性图像。
图2
图2。HBV复制过程中产生病毒环状RNA
(A类)用HBV小圆环结构（mc）转染HepG2细胞。转染三天后，提取RNA，并使用寡核苷酸（oligo-dT）或随机（random）引物通过逆转录合成互补DNA（cDNA）。未转染细胞作为阴性对照（NC）。使用指定的引物集进行PCR。引物集#1用于扩增核心区域，集#2和集#3是外向引物，理论上不会导致扩增。Mcl1扩增用作内部对照。将未逆转录的RNA（RT（−））作为PCR的阴性对照，以确认没有DNA污染。DNA标记先生。显示了两个独立实验的代表性图像。(B类)从转染HBV小环结构（mc）的HepG2细胞中提取的RNA经RNase R处理3天，并使用随机引物和引物集#2进行RT-PCR。使用未转染的细胞作为阴性对照（NC）。(C类)用HBV pgRNA表达质粒（pg）转染HepG2细胞。转染后两天，提取的RNA用或不用RNase R处理，并用随机引物逆转录。PCR使用2号引物集和Mcl1基因扩增引物作为对照。未逆转录的RNA（RT（−））用作阴性对照。DNA标记先生。显示了两个独立实验的代表性图像。(D类)DHX9敲除导致病毒循环RNA生成增加。对HBV关闭（off）、HBV持续表达（On）和HBV持续表现（shDHX9表达）的HepAD38细胞进行northern blotting，用或不用RNase R处理。使用主要跨越核心区域和β-肌动蛋白的HBV RNA探针。用溴化乙锭凝胶染色证实了RNA的完整性（28S和18S核糖体RNA的条带）和RNase处理的效果（核糖体的RNA条带消失）。显示了两个独立实验的代表性图像。
图3
图3。DHX9和核糖体蛋白与病毒环状RNA相关
(A类)使用有或无HBV表达（On或Off）的HepAD38细胞进行DHX9沉淀。阴性对照（NC）采用正常兔IgG。通过western blotting证实DHX9沉淀。显示了两个独立实验的代表性图像。(B类)从免疫沉淀中提取RNA，并使用随机引物进行反向转录。使用2号引物进行PCR。未逆转录的RNA被纳入阴性对照（RT（−））。DNA标记先生。显示了两个独立实验的代表性图像。(C类)如（a）所述，对核糖体P0/P1/P2蛋白（Ribo0-2）进行免疫沉淀。使用5%的细胞裂解物作为输入。显示了两个独立实验的代表性图像。(D类)用或不用RNase R处理从免疫沉淀（RIP）中提取的RNA，然后用随机引物进行反转录。PCR使用2号引物集和MCl1基因引物作为对照。直接从细胞中提取RNA作为输入。未逆转录的RNA被纳入阴性对照（RT（−））。DNA标记先生。显示了两个独立实验的代表性图像。
图4
图4。DHX9调节病毒循环RNA的产生和病毒蛋白水平
(A类)人类原代肝细胞HBV感染方案。在HBV感染时，表达慢病毒的shDHX9也同时被用于击倒DHX9。在感染后17天收获细胞。(B类)对细胞裂解物进行western blotting，以测定DHX9敲除细胞中DHX9和HBV表面蛋白的水平。(C类)从HBV感染的人原代肝细胞中提取的RNAs用DNase和RNase R处理，然后用随机引物进行反转录。使用Taqman引物对cDNA进行滴滴数字PCR，以绝对定量HBV环状DNA。测量一式三份。数据表示来自两个独立实验的绝对拷贝数的平均值±标准误差（SE）。*第页< 0.05. (D类)使用HBV感染的人类原代肝细胞的总RNA进行实时PCR以测量pgRNA水平（包括环状RNA）。DNA酶处理后，使用随机引物进行逆转录，并对核心区域进行实时PCR扩增，共扩增三份。数据用β-肌动蛋白标准化。数据表示两个独立实验的平均值±SE。不另作说明，无显著差异。
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