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.2018年11月1日；25(11):1168-1181.
doi:10.5551/jat.44024。 Epub 2018年5月11日。

MiR-140-3p通过靶向C-Myb和BCL-2参与外周动脉疾病的持续性再狭窄

郑荣柱 1 2, 琼和 三, 吴伟斌 1, 广汽昌 1, 陈耀 1, 杨钊 1, 王勉（音） 1, 王申明 1
附属公司

MiR-140-3p通过靶向C-Myb和BCL-2参与外周动脉疾病的持续性再狭窄

郑荣柱等。 J动脉粥样硬化血栓. .

摘要

目标：内支架再狭窄（ISR）是外周动脉疾病（PAD）血管内治疗后反复缺血和截肢的主要原因。我们之前的研究表明，miR-140-3p在PAD动脉中显著下调。然而，miR-140-3p在人PAD的ISR中的表达和功能目前尚不清楚。本研究的目的是确定miR-140-3p的表达及其在PAD ISR中的调节作用。

方法：通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和原位杂交测定RNA水平。从健康献血者或ISR患者的人股动脉中分离出原代培养的ASMC。通过Edu掺入和CCK-8测定细胞增殖。采用Annexin-Ⅴ/PI双染色法和TUNEL法检测细胞凋亡。采用大鼠颈动脉球囊成形术模型研究miR-140-3p对再狭窄的影响。

结果：与正常动脉相比，PAD和ISR动脉中的MiR-140-3p显著下调。与正常ASMCs相比，原代培养的ISR ASMCs增殖增强，miR-140-3p表达下调。miR-140-3p模拟物的转染减弱了PDGF BB在培养的ASMCs中诱导的增殖并诱导了细胞凋亡。荧光素酶报告试验表明，miR-140-3p转染通过靶向其3'-UTR，显著下调ISR ASMC中的C-Myb和BCL-2。MiR-140-3p转染可诱导ASMCs的抗增殖和凋亡，C-Myb或BCL-2的过度表达可改善这一现象。此外，动物研究表明，miR-140-3p可以通过靶向C-Myb和BCL-2减少血管成形术后的再狭窄。

结论：结果表明，miR-140-3p在PAD的ISR过程中通过靶向C-Myb和BCL-2调节ASMC功能。这一新发现可能为人类PAD提供一个有希望的治疗靶点。

关键词：BCL-2；C-Myb；原位再狭窄；MiR-140-3p；外周动脉疾病。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有经济利益冲突。

数字

图1。
图1。
miR-140-3p在动脉壁A和B的表达和分布(n个=6），PAD(n个=10）和ISR(n个=10）通过qRT-PCR测定动脉壁。C、 qRT-PCR测定正常动脉壁内皮、中膜和外膜中miR-140-3p的相对表达。D、 SM代表图α-人类正常切片和ISR切片中的肌动蛋白（绿色）和miR-140-3p（红色）联合染色（比例尺=100µm）。苏木精-伊红（HE）染色显示动脉结构。阴性对照（无SMα-肌动蛋白抗体和无miRNA探针）和扰频探针控制（无SMα-肌动蛋白抗体，但使用打乱的miRNA探针）来验证没有特定染色。绿色和红色免疫荧光分析鉴定平滑肌标志物SMα-肌动蛋白和miR-140-3p。合并的图像显示SM的共同定位α-肌动蛋白和miR-140-3p。蓝色表示DAPI的细胞核染色。E、 正常和ISR切片miR-140-3p染色IOD值的比较；正常动脉中miR-140-3p的平均表达水平定义为1.0。(n个= 10), *P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.0001.
图2。
图2。
培养的ASMC中miR-140-3p的表达在体外A、 左侧（比例尺=2 mm）和中间图片（比例栏=200µm）苏木精-伊红（HE）染色显示ISR的动脉结构。右图（比例尺=20µm），SM染色α-从ISR样品中分离的细胞中的肌动蛋白（绿色）。B、 相控显微照片显示培养的正常和ISR ASMC的形态（比例尺=100µm）。C、 Western blot分析表明培养的ISR ASMC表达较低水平的表型标记（SM-MHC和SMα-肌动蛋白）与正常ASMC相比。根据Edu和CCK-8分析，从ISR动脉中分离出的ASMC比从正常动脉中分离出来的ASMC更容易增殖（比例尺=100µm）。G、 qRT-PCR测定，ISR ASMCs中miR-140-3p的表达水平低于正常ASMCs。(n个=3至6）*P（P）< 0.05.
图3。
图3。
MiR-140-3p抑制ASMC的增殖并增加其凋亡在体外A、 通过qRT-PCR测定，PDGF-BB（20 ng/mL）诱导培养的ASMCs中miR-140-3p表达的时间依赖性降低。Edu和CCK-8检测表明，B到D，MiR-140-3p（50 nM）模拟转染ASMCs可以部分抑制PDGF-BB（20 ng/mL）诱导的细胞增殖。Annexin-V/PI双染色流式细胞术和TUNEL分析表明，E to H，MiR-140-3p（50 nM）模拟转染可增加培养的ASMC的凋亡。I至L，MiR-140-3p（50 nM）模拟转染不影响PDGF-BB（10 ng/mL）诱导的ASMC迁移，这是通过伤口闭合和Transwell分析确定的。(n个=3至6）*P（P）< 0.05.
图4。
图4。
C-Myb和BCL-2是miR-140-3p A和B的直接靶基因，通过IHC分析确定，在ISR动脉切片（底行）中，C-Myb（左栏，棕色）和BCL-1（右栏，褐色）的染色比正常动脉切片（上排；标尺=100µm）强。计算C-Myb和BCL-2染色的相对IOD值。C、 通过Western blot检测，ISR ASMC表达的C-Myb和BCL-2蛋白水平高于正常ASMC，但Bax蛋白水平低于正常ASMC。D、 Western blot检测显示，PDGF-BB（20 ng/mL）处理培养的ASMC增加了C-Myb和BCL-2蛋白的表达，但降低了Bax蛋白的表达。Western blot测定，miR-140-3p模拟物（50 nM）下调E和F、C-Myb和BCL-2蛋白水平，但miR-140-3 p抑制剂（100 nM）转染上调E和F蛋白水平。通过qRTPCR检测，miR-140-3p模拟物（50 nM）下调G和H、C-Myb和BCL-2 mRNA水平，但miR-140-3 p抑制剂（100 nM）转染上调。将I至N，MiR-140-3p模拟物（50 nM）或抑制剂（100 nM）与用C-Myb或BCL-2 3′-UTR野生型序列或3′-UTR突变序列构建的psi-CHECK-2载体共转染，并报告荧光素酶活性。(n个= 6), *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
图5。
图5。
C-Myb和BCL-2参与miR-140-3p介导的细胞效应A和B，通过Western blot检测，C-Myb与BCL-2在培养的ASMC中通过各自的慢病毒载体过度表达。通过CCK-8和Edu分析确定，C-Myb的过度表达（而非BCL-2）可显著逆转C-E、MiR-140-3p介导的ASMC抗增殖作用。Annexin-V/PI双重染色流式细胞术检测到，过度表达C-Myb或BCL-2可部分减弱miR-140-3p诱导的ASMC细胞凋亡。(n个= 3) *P（P）< 0.05
图6。
图6。
MiR-140-3p通过靶向大鼠颈动脉球囊血管成形术A和B后的C-Myb和BCL-2减少动脉再狭窄，大鼠颈动脉粥样硬化中MiR-140-3p（红色）和BCL-1或C-Myb（绿色）联合染色的代表性图形（比例尺=400µm）。Uninjury组（上排）定义为无球囊损伤的大鼠颈动脉切片。LV-GFP组（中排）定义为大鼠颈动脉段球囊损伤转位组。LV-miR-140-3p组（下排）定义为用LV-miR-140-3p转移球囊损伤的大鼠颈动脉切片。HE染色显示动脉结构。DAPI染色显示蓝色。红色免疫荧光显示miR-140-3p染色。绿色免疫荧光显示BCL-2或C-Myb染色。合并后的图像显示miR-140-3p与靶基因的共定位。C、 MiR-140-3p注入大鼠颈动脉抑制球囊血管成形术后新生内膜增生。D、 相对IOD值计算表明miR-140-3p成功进入大鼠颈动脉。E和F，相对IOD值计算表明，与对照组相比，LV-miR-140-3p给药组BCL-2和C-Myb染色降低。通过伤口闭合试验和CCK-8掺入试验测定，G to I，MiR-140-3p模拟转染既没有减弱内皮细胞的细胞迁移，也没有破坏内皮细胞的活性。J、 CD-31和CD-34染色表明，miR-140-3p（比例尺=400µm）不会减弱内皮化。(n个= 6), *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.
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