Topical Application of Culture-Expanded CD34+ Umbilical Cord Blood Cells from Frozen Units Accelerates Healing of Diabetic Skin Wounds in Mice

doi:10.1002/sctm.17-0302

.2018年8月；7(8):591-601.

doi:10.1002/sctm.17-0302。 Epub 2018年5月12日。

冻存脐带血培养扩增CD34+细胞局部应用促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合

詹妮弗·怀特利¹, 特蕾莎·周^1 2, 希布雷特·阿迪苏¹, 阿尔曼·基廷^三, 伊恩·罗杰斯^1 2 4

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市西奈卫生系统Lunenfeld Tanenbaum研究所。
²多伦多大学生理学系。
^三加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院细胞治疗项目玛格丽特公主癌症中心癌症临床研究室（CCRU）克伦贝尔研究所。
⁴加拿大安大略省多伦多市妇产科生殖科学部。

PMID： 29752867
预防性维修识别码： PMC6090513
内政部： 10.1002/季度17-0302

冻存脐带血培养扩增CD34+细胞局部应用促进糖尿病小鼠皮肤创面愈合

詹妮弗·怀特利等。干细胞Transl Med. 2018年8月.

.2018年8月；7(8):591-601.

doi:10.1002/sctm.17-0302。 Epub 2018年5月12日。

作者

詹妮弗·怀特利¹, 特蕾莎·周^1 2, 希布雷特·阿迪苏¹, 阿尔曼·基廷^三, 伊恩·罗杰斯^1 2 4

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市西奈卫生系统Lunenfeld Tanenbaum研究所。
²多伦多大学生理学系。
^三加拿大安大略省多伦多市玛格丽特公主医院细胞治疗项目玛格丽特公主癌症中心癌症临床研究所。
⁴加拿大安大略省多伦多市妇产科生殖科学部。

PMID： 29752867
预防性维修识别码：下午609513
内政部： 10.1002/季度17-0302

摘要

慢性和无法愈合的伤口是2型糖尿病患者面临的持续健康问题。随着2型糖尿病（T2DM）发病率的增加，慢性创伤和截肢的发病率将增加。T2DM与外周动脉闭塞性疾病相关，导致轻微创伤后出现无法愈合的皮肤溃疡。患者出现剧烈疼痛，限制了他们的行动能力、工作能力和照顾自己的能力，从而给家庭和社会带来了巨大负担。来自脐血（UCB）的CD34+细胞在成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）、干细胞因子和Flt3-配体中生长，产生大量细胞，这些细胞具有增殖能力，并具有促进组织再生的特性。本研究的目的是评估体外培养的CD34+细胞最终会被排斥的情况，以便我们能够从植入和分化的治疗效果中分离旁分泌信号介导的治疗效果。为此，我们使用db/db小鼠作为糖尿病皮肤溃疡的模型。在这里，我们报告了从冷冻单元中体外培养的UCB CD34+细胞可以加速伤口愈合，并导致全层皮肤再生。这项研究为组织再生领域的库存UCB单元提供了新的指示。2018年干细胞转化医学；7:591-601.

关键词：糖尿病；皮肤溃疡；干细胞；脐带血。

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数字

图1
体外培养中CD34+细胞的生长特性。从冷冻脐带血单位分离的CD34+细胞将在补充有FGF4、干细胞因子和Flt3配体的特定培养物中增殖。使用100%堆叠折线图显示四种细胞群（CD34+/CD38−、CD34+/CD38+、CD34−/CD38+、CDM34−/CD38+和CD34−/CD38−）的变化。随着时间的推移，CD34+细胞在培养过程中丢失。**（A）**：在培养的前4–8天，CD34+细胞的富集群体优先在培养中保持，正如观察到的那样，CD34+cells在群体中的比例增加。在此期间，整个人口将增长10倍。**（B）**：相同的趋势在以下样本组中显示n个 = 10.CD34+细胞总数从第0天到第7天增加，到第14天保持在～80%，然后下降。在第21天（红色箭头），总CD34+为人群的～40%。到第70天，增殖率下降，大多数细胞失去CD34表达。

图2
MPSC治疗的疗效。受伤小鼠接受MPSCs外敷伤口。对照动物受伤，但没有接受细胞。**（A）**：局部应用MPSC(n个 = 25）与对照组相比，伤口闭合更快(n个 = 23）（*，第页 < .05).（B）：对db/db小鼠较重的糖尿病亚组的分析显示，局部应用MPSC(n个 = 13）与体重匹配的对照组相比，加强了伤口修复(n个 = 10）表明MPSC即使在严重肥胖的环境中也能正常工作。**（C）**：骨髓MSC(n个 = 10）与MPSC进行比较(n个 = 15）和未处理的控件(n个 = 14). MPSC和BM-MSC显示出相似的治愈率，并且两者与对照组有显著差异。数值表示为原始伤口的百分比（100%） ± 扫描电镜*，第页 < .5第页通过双向方差分析和Bonferroni后验确定值。缩写：ANOVA，方差分析；BM‐MSC，骨髓间充质干细胞；多潜能干细胞；间充质干细胞。

图3
在多潜能干细胞（MPSC）治疗的伤口中观察到表明角质形成细胞激活和肉芽组织形成的蛋白表达。**（A、B）**：局部MPSC处理伤口（100万细胞）的横截面在第7天用H&E染色，显示角质形成细胞在伤口上迁移，并形成细胞外基质（ECM）（箭头）。**（C）**：用抗细胞角蛋白-6抗体和红色荧光二级抗体染色的同一组织的连续切片显示，在毛囊（箭头所示）和增殖基底层中观察到活化角质形成细胞中诱导细胞角蛋白6（红色）表达。**（D）**：在肉芽组织中的成纤维细胞附近观察到IV型胶原（绿色荧光二级抗体）。**（E）**：层粘连蛋白（绿色荧光二级抗体）是健康皮肤中ECM的一种成分，在伤口愈合过程中由角质形成细胞和成纤维细胞表达，并且可以在生成的新组织中看到。**（F）**：catenin（绿色荧光二级抗体）也由活化的角质形成细胞表达，其表达模式类似于细胞角蛋白-6。**（G、H）**：在第7天，对照小鼠也表现出细胞角蛋白-6（红色荧光二级抗体）和儿茶素（绿色荧光二级抗原）染色。第7天的控制伤口显示出与第7天局部MPSC治疗伤口相似的模式。尽管开始了类似的伤口修复，但对照组织的再生并未持续，因为第23天的组织样本显示伤口闭合率与MPSC治疗的伤口不同。（见图1）。所有图片的放大倍数都相同。酒吧 = 250微米。

图4
第23天伤口的大体组织分析显示新组织的质量存在差异。使用6mm活检穿孔机产生全层皮肤伤口。通过增加夹板，通过重新上皮化使伤口愈合，以防止伤口边缘一起移动。**（A）**：MPSC治疗的伤口在第7天的伤口边缘有明显的组织白色斑块（视为推进上皮组织）（箭头所示）。在第23天，对照伤口和治疗伤口都被完全覆盖。**（B）**：伤口在第23天被切除，并在黑色背景下拍照。对于对照伤口，可以在伤口中心观察到黑色背景，表明覆盖物很薄，而对于MPSC治疗的伤口，没有观察到黑色的背景，表明组织层较厚。缩写：MPSC，多能干细胞。

图5
局部应用多潜能干细胞（MPSC）可使皮肤再生质量更好。伤口的组织学分析表明，与注射MPSC和对照组相比，局部MPSC治疗的伤口具有更好的愈合效果。**（A）**：比较第23天未治疗（对照）、注射MPSC和局部应用MPSC的伤口，表明局部治疗伤口的皮肤结构更好。箭头表示伤口边缘。未经治疗和注射的皮肤都有厚厚的表皮和真皮纤维增生（与外用治疗皮肤的H&E染色相比）Bar = 50微米。**（B）**：梅森三色染色显示角蛋白（红色）、胶原蛋白（蓝色）、红细胞（橙色）和肌肉（红色）。天狼星红染色显示角蛋白（黄色）、胶原蛋白（红色）、红细胞（黄色）和肌肉（黄色）。在损伤后第23天，通过肉眼观察，所有三个治疗组的细胞角蛋白数量相似，但在局部治疗的伤口中，伤口的重塑更为严重，出现了有组织的表皮层（E）、真皮层（D）、皮下层（H），包括脂肪层（A）、肉苁蓉层（P）血管层（BV）、，和再生毛囊（箭头‐H&E）。对照组和注射组也缺乏肉质脂膜层、血管，没有再生毛囊。将经局部治疗的皮肤与未受损的皮肤进行比较，结果显示，经局部治疗后的伤口中正在形成新生毛囊（箭头-H&E），这表明到第23天，组织重塑尚未完成。酒吧 = 250微米。

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