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.2018年6月；20(6):594-609.
doi:10.1016/j.neo.2018.02.012。 Epub 2018年5月7日。

用线粒体VDAC1基肽靶向小鼠肝癌及其相关病理学

斯里尼瓦斯·皮塔拉 1, 雅科夫·克雷林 1, 瓦尔达·肖珊·巴马茨 2
附属机构

基于线粒体VDAC1的肽靶向小鼠肝癌及其相关病理

斯里尼瓦斯·皮塔拉等。 肿瘤形成. 2018年6月.

摘要

肝细胞癌（HCC）是全球第三大致死性癌症。尽管在确定危险因素方面取得了进展，但肝癌的发病率仍在增加。此外，治疗选择有限，生存率低。因此，迫切需要替代和创新的治疗策略。R-Tf-D-LP4是一种来源于线粒体多功能蛋白电压依赖性阴离子通道（VDAC1）的细胞穿透肽，被认为是一种高效的肝癌治疗方法。最近，我们证明R-Tf-D-LP4在小鼠模型中诱导凋亡并抑制肿瘤生长。我们现在证明R-Tf-D-LP4在三种不同的肝癌小鼠模型中诱导癌肝源性细胞系的凋亡并抑制肿瘤生长。这些包括二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌、代谢性高脂肪饮食诱导的肝癌，以及使用皮下HepG2细胞异种移植模型。将该肽静脉注射到携带肿瘤的DEN治疗小鼠体内，可导致肿瘤生长的剂量依赖性抑制，直至完全消除肿瘤。肝切片的TUNEL染色显示肽诱导的细胞凋亡。肝切片的苏木精/伊红和天狼星红染色显示纤维化形成减少。免疫组织化学染色显示R-Tf-D-LP4处理的小鼠肝脏中α-SMA表达细胞数量减少。此外，R-Tf-D-LP4处理的小鼠肝组织中的巨噬细胞减少。DEN处理小鼠的肝脏切片显示脂肪肝病理，表现为脂肪肝、炎症、气球样变性和纤维化；肽处理后全部消除。肽治疗还抑制了HFD诱导的非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌小鼠模型中的肿瘤发展。在HepG2皮下移植瘤中，R-Tf-D-LP4抑制肿瘤生长。

结论：这些结果表明，基于VDAC1的肽R-Tf-D-LP4对肝癌细胞具有多重作用，导致细胞能量和代谢稳态受损，诱导细胞凋亡，消除肝癌相关过程，从而为肝癌提供了一种有前景的治疗方法。

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数字

图1
图1
VDAC1在肝肿瘤和癌细胞系中过表达，并且基于VDAC1的肽R-Tf-D-LP4诱导细胞死亡。（A） 包含人类正常肝脏的组织阵列（US Biomax）(n个 = 5） 和肝癌(n个 = 19） 用抗VDAC1抗体染色的切片。显示了在所示强度下染色的截面百分比。非癌细胞和肝癌衍生细胞中HK-II、VDAC1和Bcl-xL（B）表达的免疫印迹分析。（C） ●●●●。所示细胞系中HK-II（黑色条）、VDAC1（浅灰色条）和Bcl-xL（深色条）的水平与其在T-REx-293细胞系中的表达水平相关。（D） 健康和DEN处理的小鼠癌源性肝脏中HK-II、VDAC1和Bcl-xL表达的免疫印迹分析(n个 = 3). 蛋白质表达水平也增加了一倍。（E） 非癌细胞和肝癌衍生细胞系中TfR表达的免疫印迹。（F） R-Tf-D-LP4能有效诱导肝癌细胞株的细胞死亡。人HepG2(○), 胡H7(▲), 和小鼠BNL1MEA.7R.1细胞(●) 用R-Tf-D-LP4孵育6小时，并按照材料和方法中的描述分析细胞死亡。（G） 集成电路50具有各种指示突变的肝癌细胞系中肽诱导凋亡的值（μM）。结果显示平均值±SD(n个 = 3).
图2
图2
R-Tf-D-LP4诱导细胞死亡：作用模式。如材料和方法所述，R-Tf-D-LP4诱导HepG2细胞中HK-I-GFP（A）和内源性HK-I的分离，通过细胞溶质组分的免疫印迹分析并表示为相对单位（B）。（C） R-Tf-D-LP4降低细胞ATP水平，如材料和方法所述。结果显示平均值±SE(n个 = 3) (*P（P） ≤ .05, **P（P） ≤ .01). （D） R-Tf-D-LP4诱导的细胞c（c）如材料和方法中所述，通过免疫印迹胞质部分分析线粒体的释放。通过Annexin V-FITC、PI染色和流式细胞术分析（E，F）R-Tf-D-LP4-诱导的细胞凋亡。对照组和R-Tf-D-LP4（5μM）处理的HepG2细胞（E）的典型FACS分析。细胞凋亡与R-Tf-D-LP4浓度的关系。结果显示平均值±SE(n个 = 3).
图3
图3
基于VDAC1的肽R-Tf-D-LP4在DEN诱导的小鼠肝癌模型中抑制肿瘤生长。（A） DEN诱导肝癌发展和治疗计划的示意图。（B） 静脉注射HBSS或R-Tf-D-LP4（18 mg/kg，n个 = 30）持续10周，如材料和方法所述。（C，D）从DEN-treated、peptide-ntreated和R-Tf-D-LP4-treated DEN-mice中解剖（C）和称重（D）肝脏。（E） 未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠肝脏切片的H&E染色[0,10,14 mg/kg(n个 = 8） 和18mg/kg，n个 = 30]. （F） 显示了未经治疗（显示有肿瘤）和R-Tf-D-LP4治疗小鼠（18 mg/kg）肝脏切片的H&E染色的更高倍。用Pannoramic MIDI，3DHISTECH显微镜（Pannoramic-viewer，3DHESTECH）测量每个肝脏的肿瘤数量（G）和肿瘤面积（H）。(*P（P） ≤ .05, ***P（P） ≤ .001).
图4
图4
基于VDAC1的肽R-Tf-D-LP4在疾病晚期抑制DEN诱导的小鼠肝癌模型中的肿瘤生长。（A） 第37至43周DEN诱导肝癌发展和治疗计划的示意图。（B） 37周时，从R-Tf-D-LP4未经处理的DEN处理小鼠中解剖肝脏。（C） 在第43周从R-Tf-D-LP4未经处理的DEN处理小鼠中解剖肝脏。（D） 在第43周从R-Tf-D-LP4（18 mg/kg）处理的DEN处理小鼠中解剖肝脏。（E） 用R-Tf-D-LP4（18 mg/kg）治疗和未治疗的DEN对照组和DEN治疗组小鼠的肝脏重量。（F） 未经DEN治疗的小鼠和经R-Tf-D-LP4治疗的小鼠（18 mg/kg）肝脏中的肿瘤结节数量(**P（P） ≤ .01, ***P（P） ≤ .001).
图5
图5
R-Tf-D-LP4治疗DEN诱导的肿瘤可降低代谢相关酶和增殖标记物Ki-67的表达。（A） 用抗Ki-67抗体和苏木精染色的未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠（18 mg/kg）的代表性肝脏切片。（B） Ki-67阳性细胞的定量分析(*P（P） ≤ .05, ***P（P） ≤ .001). 使用适当的抗体对未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠的代表性肝脏切片进行IHC染色，以检测谷氨酸-1、HK-II、GAPDH和LDHA（C），以及VDAC1、柠檬酸合成酶和ATP合成酶5a（D）。切片也进行苏木精染色，并通过显微镜观察（徕卡DM2500）。（E） 如材料和方法中所述，使用HistoQuant软件对全景扫描仪生成的图像中显示强度水平的IHC染色切片进行定量分析。
图6
图6
R-Tf-D-LP4治疗DEN暴露小鼠诱导细胞凋亡并改变凋亡相关蛋白的表达。（A） 通过特异性抗体分析未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠中DEN干预和DEN诱导的肝肿瘤中TfR表达的免疫印迹。β-肌动蛋白免疫染色作为负荷控制。（B） 未经处理和R-Tf-D-LP4处理的DEN处理小鼠肝切片的TUNEL染色。红色和绿色分别表示PI核染色和TUNEL染色。（C） 未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠代表性肝切片的IHC，用抗细胞染色c（c）和抗AIF抗体。（D） 使用抗细胞免疫印迹法对未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠的肝裂解物进行免疫印迹c（c）抗AIF、抗caspase-3和抗caspase-8抗体。（E） 免疫印迹定量分析，如（D）所示(n个 = 3). DEN处理小鼠（黑条）；DEN处理小鼠并用肽（18 mg/kg）（灰色条）处理。
图7
图7
R-Tf-D-LP4治疗DEN诱导的HCC可消除肝脂肪变性病理、炎症和纤维化。（A-E）用天狼星红（A）或抗α-SMA（B）或抗F4/80抗体（C）染色显示巨噬细胞浸润的DEN处理小鼠、R-Tf-D-LP4未处理小鼠或R-Tf-D-LP4处理小鼠的代表性肝脏切片。IF染色检测CD3+和B220（D）、CD4+、CD8+或FOXP3（E）。每个图像中都显示了相对染色强度（%）。这些结果来自于两只小鼠的几张图像，用于每种抗体染色。（F） H&E染色的代表性肝脏切片显示了DEN诱导的肝肿瘤中的肝脂肪变性病理学，而R-Tf-D-LP4治疗的小鼠中没有这种病理学。
图8
图8
R-Tf-D-LP4在代谢（HFD-32）诱导的小鼠肝癌（NASH-HCC）模型中抑制肿瘤生长。（A） HFD-32诱导的肝癌发展和治疗方案的示意图。小鼠被随机分为两组。从第16周到第22周，当小鼠被处死时，一组静脉注射HBSS（对照组），另一组注射R-Tf-D-LP4（18 mg/kg）。（B） 未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠的肝脏解剖(n个 = 10). （C） 未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠的肝切片用H&E染色。蓝色圆圈表示肿瘤。（D，E）如图3所示，测量每个肝脏的平均肿瘤数和相对肿瘤面积F类结果显示平均值±SE(n个 = 5, ***P（P） ≤ .001). （F） 未经治疗和R-Tf-D-LP4治疗小鼠的代表性肝切片用H&E染色，显示肽缺乏小鼠的脂肪变性和炎症，但R-Tf-D-LP4治疗的小鼠没有。
图9
图9
R-Tf-D-LP4型我抑制HepG2异种小鼠模型中的肿瘤生长。（A） 将HepG2细胞接种到裸鼠体内，如材料和方法所述。当肿瘤体积为75至100毫米时三，将小鼠分为两个匹配组（5只/组），每2天瘤内注射HBSS(●, 或R-Tf-D-LP4（O，40μM）。计算的平均肿瘤体积表示为平均值 ± SE公司(n个 = 5). 解剖肿瘤（B）及其重量（C）。结果显示平均值±SE(n个 = 11) (*P（P） ≤ .05).
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