Excessive Plasmin Compromises Hepatic Sinusoidal Vascular Integrity After Acetaminophen Overdose

doi:10.1002/hep.30070

.2018年11月；68(5):1991-2003.

doi:10.1002/hep.30070。 Epub 2018年9月20日。

过量服用醋氨酚后过量血浆蛋白损害肝窦血管完整性

四七高^1 2, 罗伯特·西拉西·蒙萨特¹, 阿曼达·R·比哈尔¹, 弗洛里亚·卢普^1 2, 科特尼·T·格里芬^1 2

附属公司

¹俄克拉荷马医学研究基金会心血管生物学研究项目。
²俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心细胞生物学系。

PMID： 29729197
预防性维修识别码： PMC6204085型
内政部： 10.1002/hep.370年

过量服用醋氨酚后过量血浆蛋白损害肝窦血管完整性

高思琪等。肝病学. 2018年11月.

.2018年11月；68(5):1991-2003.

doi:10.1002/hep.30070。 Epub 2018年9月20日。

作者

四七高^1 2, 罗伯特·西拉西·蒙萨特¹, 阿曼达·R·比哈尔¹, 弗洛里亚·卢普^1 2, 科特尼·T·格里芬^1 2

附属公司

¹俄克拉荷马医学研究基金会心血管生物学研究项目。
²俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心细胞生物学系。

PMID： 29729197
预防性维修识别码： PMC6204085型
内政部： 10.1002/hep.370年

摘要

丝氨酸蛋白酶纤溶酶通过激活基质金属蛋白酶直接或间接降解细胞外基质（ECM）成分。过多的纤溶酶活性和随后的ECM降解会导致发育中胚胎的肝窦脆性和出血。我们在此报告，在小鼠对乙酰氨基酚（APAP）过量模型中，过多的纤溶酶活性同样会损害成年动物肝窦血管的完整性。我们发现，在APAP过量后6小时，肝纤溶酶活性显著上调。这种纤溶酶上调先于肝血管周围ECM成分纤维连接蛋白的降解和小叶中心窦出血。重要的是，服用药物性纤溶酶抑制剂氨甲环酸或纤溶酶原（纤溶酶的循环酶原）的基因减少，可以改善APAP诱导的肝纤维连接蛋白降解和窦性出血。结论：这些研究表明，血浆纤溶酶的降低可稳定APAP过量后肝窦血管的完整性。（《国际肝病》2018；00:1-13）。

PubMed免责声明

数字

**图1。APAP诱导的小叶中心窦出血依赖于纤溶酶**
C57Bl/6J雄性小鼠禁食16小时，注射300 mg/kg APAP或生理盐水作为对照，并在生理盐水或APAP治疗后的指定时间灌注固定并安乐死，以通过苏木精和伊红染色进行组织学肝脏分析。（A）肝脏切片的方框区域在每个图像下方放大，然后渲染为黑白对比图像，以量化出血区域（如图所示，黑白对比）。CV：中央静脉；PV：门静脉。（B）在APAP过量后2小时给予药理学纤溶酶抑制剂氨甲环酸（TA；600 mg/kg）或载体对照（盐水），并在APAP过量后24小时收获肝脏进行分析。出血面积的计算和绘图如（A）所示。（C）利特马特*Plg公司^+/+*（重量），*Plg公司^+/−*、和*Plg公司^−/−*给小鼠服用过量的APAP，24小时后取肝脏进行分析。计算出血面积并绘制图表，如（A）所示。典型的组织学图像显示在A-C中；图表上的每个符号代表一只独立动物的5个分析切片的平均值，条形代表平均出血面积±SEM。统计分析采用双尾非配对t检验（B）或单向方差分析与Tukey多重比较检验（C）***P（P）*<0.01; *****P（P）*<0.0001. 比例尺：500µm（A，上面板）；100µm（A，中间面板；B和C）。

**图2。APAP过量后6小时，小鼠肝脏中的纤溶酶活性上调**
（A）在生理盐水与APAP治疗后的特定时间产生全肝裂解物。上清液与纤溶酶特异性Boc-Glu-Lys-Lys-MCA肽（10 mmol/L）结合后用于测定纤溶酶活性，该肽在切割时会发出荧光。在荧光计上生成数据，并用平均相对纤溶酶活性±SEM表示。（B）在37°C下，用Boc-Glu-Lys-Lys-MCA覆盖生理盐水和APAP治疗6小时后从小鼠收集的未固定肝脏切片30分钟，以检测原位纤溶酶活度（绿色）；DAPI（蓝色）用作副染色。血管管腔标有星号（*）。这些图像代表了四个在不同小鼠切片上进行的独立实验。比例尺：100µm。（C）生理盐水与APAP治疗后6小时收集的全肝裂解物中纤溶酶、纤溶酶原和GAPDH（负荷控制）的Western blot。每个通道都包含来自单独鼠标的样本。阳性对照区含有人血浆中的纤溶酶原。右侧显示了将单个纤溶酶带归一化为各自的GAPDH带并再次归一化至平均APAP治疗值的定量；误差条代表±SEM。（D）纤溶酶原转录本(*Plg公司*)，尿激酶纤溶酶原激活剂(*美国公共行政管理局*)尿激酶纤溶酶原激活物受体(*uPAR公司*)和组织纤溶酶原激活剂(*t驻车辅助系统*)在生理盐水或APAP治疗后所示时间，通过qPCR对小鼠肝脏样本进行检测。将数据归一化为2个内务管理控制基因，并表示平均值±SEM；N=每组3-4只小鼠。使用双向方差分析和Sidak的多重比较检验（a）、双尾非配对t检验（C）或双向方差分析与Dunnett的多重比较试验（D）进行统计分析**P（P）*<0.05; ***P（P）*<0.01; ****P（P）*<0.001; *****P（P）*<0.0001.

**图3。在APAP过量后6小时，窦状内皮细胞看起来没有坏死，但有海绵状间隙**
（A）用盐水或APAP处理6小时的两组小鼠接受小叶中心正弦血管的TEM分析；显示了具有代表性的图像。窦状内皮细胞（人工假绿色）没有肿胀和空泡化增加的迹象（蓝色星号），如APAP治疗后周围肝细胞所见。（B）两组小鼠在APAP过量后2小时接受TA或溶媒对照（生理盐水）治疗，在APAP过度后6小时进行分析，并通过SEM与生理盐水治疗的动物进行比较。肝窦内皮细胞表面出现小窗口（主图像下方放大面板中的绿色箭头）（以黄色勾勒）在每个条件下。在每种情况下，内皮细胞表面也出现了更大的间隙，尽管在盐水处理和APAP+TA处理的动物的样品中，这些间隙似乎内衬着纤维网（左侧和右侧放大面板中的蓝色箭头）。相比之下，在APAP+溶媒处理的动物样品中，较大的间隙似乎更具海绵状，且底层网状结构更少（中央放大面板中的红色箭头）。虽然在APAP+TA治疗动物的样品中可以看到Disse的扩大空间（红色星号），但仅在APAP+溶媒治疗动物的样本中检测到变性红细胞（伪粉红色）。Hep=肝细胞。

**图4。APAP过量后，肝血管周围的纤维结合蛋白显著降解**
（A）在用生理盐水处理24小时或用APAP处理2或24小时的小鼠肝切片中，对ECM组分纤维连接蛋白、I型胶原、IV型胶原和层粘连蛋白进行了免疫染色（绿色）。上面板显示中央静脉区域的免疫染色，下面板显示门静脉三联区的染色，如胆道标志物细胞角蛋白19（红色）所示。Hoechst（蓝色）被用作核染色。比例尺：50µm。该图表示纤维连接蛋白染色±SEM的平均荧光强度，在3-4只小鼠的4个样品中进行了测量。（B）生理盐水与APAP治疗后24小时收集的全肝裂解物中纤维连接蛋白和GAPDH（负荷控制）的Western blot。每个通道都包含来自单独鼠标的样本。右侧显示了将单个纤维连接蛋白条带归一化为各自的GAPDH条带并再次归一化至平均盐水治疗值的量化；误差条代表±SEM。使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验（a）和非配对双尾t检验（B）进行统计分析**P（P）*<0.05; ***P（P）*<0.01.

**图5。抑制纤溶酶原挽救APAP过量后窦周纤维连接蛋白降解**
（A）用抗纤维连接蛋白抗体（绿色）和胆道标志物细胞角蛋白19（红色）对生理盐水或APAP处理24小时的小鼠肝切片进行免疫染色；Hoechst（蓝色）被用作核染色。在APAP过量服用2小时后，也用溶媒（生理盐水）或TA治疗APAP治疗的动物，以评估药理学纤溶酶抑制对纤维连接蛋白降解的影响。右侧的图表表示纤维粘连蛋白染色±SEM的平均荧光强度，在每组3-5只小鼠的4个样品中进行测量。（B）盐水与APAP处理（2小时+/-TA处理）后24小时收集的全肝裂解物中纤连蛋白和GAPDH（负荷对照）的蛋白质印迹。每个通道都包含来自单独鼠标的样本。右侧显示了将单个纤维连接蛋白条带归一化为各自的GAPDH条带并再次归一化至平均盐水治疗值的量化；误差条代表±SEM。（C）抗纤维连接蛋白抗体（绿色）用于对同窝婴儿的肝脏切片进行免疫染色*Plg公司^+/+*（重量），*Plg公司^+/−*、和*Plg公司^−/−*APAP治疗小鼠24小时；赫斯特（蓝色）被用作核复染剂。右侧的图表表示纤维粘连蛋白染色±SEM的平均荧光强度，在每组3-5只小鼠的4个样品中进行测量。（D） APAP治疗24小时后从窝友处收集的全肝裂解物中纤维连接蛋白和GAPDH（负荷控制）的代表性western blotPlg公司^+/+（重量），*Plg公司^+/−*、和*Plg公司^−/−*老鼠。每个通道都包含来自单独鼠标的样本。将单个纤维连接蛋白条带归一化为各自的GAPDH条带，并再次量化为*Plg公司^−/−*右边是老鼠；数据代表每组3-5只小鼠的平均值±SEM。A-D的统计分析采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较检验（A，C）、Tukey的多重对比检验（B，D）**P（P）*<0.05; ***P（P）*<0.01; ****P（P）*<0.001. 比例尺：50µm。

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1. Castellino FJ，Ploplis VA。纤溶酶原/纤溶酶系统的结构和功能。血栓止血。2005;93:647–654.-公共医学
1. Davis GE、Pintar Allen KA、Salazar R、Maxwell SA。纤溶酶激活基质金属蛋白酶-1和-9调节三维胶原基质中胶原凝胶收缩和毛细血管退化的新型内皮细胞介导机制。细胞科学杂志。2001;114:917–930.-公共医学
1. Ingram KG、Curtis CD、Silasi-Monsat R、Lupu F、Griffin CT。NuRD染色质重塑酶CHD4通过转录调节细胞外基质蛋白水解促进胚胎血管完整性。公共科学图书馆-遗传学。2013;9:e1004031。-项目管理咨询公司-公共医学
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[3] Castellino FJ，Ploplis VA。纤溶酶原/纤溶酶系统的结构和功能。血栓止血。2005;93:647–654.-公共医学

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