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.2018年5月3日；70（3）：502-515e8。
doi:10.1016/j.molcel.2018.03.029。

mTORC1偶联物对SOD1磷酸化的营养传感和氧化还原调节

Chi Kwan Tsang先生 1, 苗晨 2, 新城 三, 齐艳梅（Yanmei Qi） 三, 尹晨（音） 2, 伊沙尼·达斯 三, 李晓星 2, 布林达·瓦拉特 4, 李武夫 2, 超南倩 2, 王慧云 5, 艾琳·怀特 6, 斯蒂芬·K·伯利 7, X F史蒂文·郑 8
附属公司

mTORC1偶联物对SOD1磷酸化的营养传感和氧化还原调节

Chi Kwan Tsang先生等。 摩尔细胞. .

摘要

营养素不仅是促进生物能量学和生物合成的有机化合物，也是控制生长和代谢的关键化学信号。营养物质极大地影响活性氧（ROS）的产生，活性氧在正常生理和疾病中发挥着重要作用。营养信号如何与氧化还原调节结合是一个有趣但尚未完全理解的问题。在此，我们报道超氧化物歧化酶1（SOD1）是雷帕霉素复合物1（mTORC1）营养信号机制靶点的保守成分。mTORC1通过酵母S39和人类T40的可逆磷酸化调节SOD1活性，以响应营养素，从而调节ROS水平并防止DNA氧化损伤。我们进一步表明，SOD1激活可提高肿瘤细胞在缺血肿瘤微环境中的存活率和肿瘤形成率，并保护其免受化疗药物顺铂的影响。总之，这些发现确定了一种保守的机制，真核生物通过这种机制动态调节氧化还原稳态，以响应不断变化的营养条件。

关键词：沃伯格；癌症；顺铂；缺血；mTOR；营养物；雷帕霉素；活性氧物种；氧化还原；超氧化物歧化酶1。

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利益声明

作者声明没有已知的利益冲突。

数字

图1
图1。TORC1负调节酵母中的SOD1活性
（A） 删除SOD1标准在酵母中呈现雷帕霉素抗性表型。野生型（WT），草皮1Δ,草皮2Δ和ccs1号机组将Δ细胞连续稀释（10倍），在不含或含有雷帕霉素亚抑制浓度（1 nM）的YPD板上发现，并在30°C下孵育2（−雷帕霉素）至5（+雷帕霉素）天。（B） 质粒携带SOD1标准抑制雷帕霉素耐药表型草皮1Δ应变。重量，草皮1Δ和草皮1Δ [SOD1-MYC9标准]酵母菌株对雷帕霉素的敏感性如上所述。（C） 雷帕霉素迅速激活SOD1的活性，但不激活SOD2。用雷帕霉素处理酵母细胞不同时间，用凝胶内SOD活性测定法检测SOD1和SOD2的活性。右侧面板显示了结果的量化（表示为相对于时间零点的相对活性；平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。草皮1Δ应变用作阴性对照。（D） 雷帕霉素对SOD1的激活依赖于其铜伴侣CCS1。重量，草皮1Δ和ccs1号机组雷帕霉素处理Δ细胞不同时间。右侧面板显示了结果的量化（平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。（E） 雷帕霉素激活SOD1是TORC1抑制的结果。酵母细胞表达任务大纲1或右后TOR1用雷帕霉素处理并测定SOD活性。下部面板显示了SOD1活性的量化（平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。（F） TORC1基因失活刺激SOD1活性。WT和tor1Δtor2-dg将菌株转移到限制性温度（37°C）下不同时间，并通过凝胶内分析测定SOD1活性。下部面板显示SOD1活性的量化（平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。另请参见图S1。
图2
图2。酵母营养素对细胞活性氧的SOD1依赖性调节
（A） 葡萄糖饥饿激活SOD1。将WT酵母细胞从葡萄糖中饥饿（不含葡萄糖的SC）不同时间。SOD1活性通过凝胶内分析测定。右侧面板显示SOD1活性的量化（平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。（B） 将营养物质从葡萄糖转化为非发酵碳源，激活SOD1。将WT酵母细胞培养液从葡萄糖培养基改为甘油培养基培养不同时间。SOD1活性通过凝胶内分析测定。右侧面板显示SOD1活性的量化（平均值±S.D.；n=3；*p<0.05，学生的t吨-测试）。（C） SOD1对于在不同营养条件下防止过量超氧物非常重要。WT和草皮1将Δ细胞培养物从葡萄糖培养基改为甘油培养基培养3小时。用二氢乙硫酸氢钠（DHE）染色分析细胞超氧化物。图像由荧光显微镜捕获。比例尺，10µm。右侧面板，不同染色强度的细胞定量（N>100）。（D） SOD1对于在不同营养条件下防止活性氧过量非常重要。WT和草皮1将在葡萄糖培养基中培养的Δ细胞换成甘油培养基培养3小时，并用二氢罗丹明（DHR）染色分析总ROS。通过荧光显微镜拍摄图像。比例尺，10µm。右侧面板显示不同染色强度（N>100）的细胞数量。（E） SOD1在不同营养条件下对防止DNA氧化损伤很重要。在与图2C相同的条件下，使用γ-H2AX抗体通过免疫荧光（IF）进行DNA氧化损伤。比例尺，10µm。右侧面板显示阳性染色细胞的定量（平均值±S.D.，n=3，*p<0.05，Student’St吨-测试）。另请参见图S1。
图3
图3。TORC1与SOD1相互作用，并在酵母中S39处磷酸化SOD1
（A） 雷帕霉素诱导SOD1蛋白电泳移位。用100 nM雷帕霉素处理表达SOD1-Myc9的酵母细胞不同时间。用Myc特异性抗体免疫印迹分析SOD1的电泳迁移率。（B） S39位于引导带负电O流入的带正电隧道的入口处（用虚线圈出）2−底物到活性位点。所示为酵母SOD1的3D晶体结构，表面静电，S39处于未磷酸化（顶部）或模拟磷酸化状态（底部）。蓝色，带正电荷；白色，神经；红色，负电荷；静电势，kcal-mol−1e（电子）−1（C）S39以雷帕霉素敏感方式磷酸化。用100 nM雷帕霉素处理表达WT或突变SOD1-Myc9的酵母细胞30分钟。用Myc特异性抗体免疫印迹分析SOD1-Mmy9的电泳迁移率。（D） S39磷酸化受营养物质调节。表达WT或S39突变SOD1-Myc9蛋白的酵母细胞从葡萄糖（D，葡萄糖）转移到甘油培养基（G）中3小时。SOD1-Mmy9的电泳迁移率是用Myc特异性抗体进行免疫印迹的。（E） TORC1以营养依赖的方式与SOD1相互作用。表达SOD1-Myc9的酵母细胞从葡萄糖（D，葡萄糖）转移到葡萄糖或甘油（G）培养基中3小时。用TOR1特异性抗体免疫沉淀TORC1。通过免疫印迹分析TORC1与SOD1-Myc9的相互作用。（F） TORC1在S39磷酸化SOD1。将葡萄糖培养基中培养的细胞的免疫沉淀TORC1与细菌产生的重组GST-SOD1孵育重量或GST-Sod1S39A系列在γ的存在下-[32P] -ATP。通过放射自显影术检测GST-SOD1蛋白的磷酸化。另见图S1和S2；表S1。
图4
图4。酵母中S39磷酸化介导SOD1和细胞ROS的营养调节
（A） 营养素通过S39磷酸化调节SOD1活性。将表达WT和S39突变SOD1的酵母细胞从葡萄糖培养基转变为甘油培养基3小时。分别用凝胶内SOD测定和免疫印迹法测定SOD1活性和蛋白质。（B） 图4A中SOD1活性的量化。数据表示三个独立实验的平均值±S.D.。*p<0.05，学生t吨-测试。（C） S39磷酸化对控制细胞超氧化物对不同营养条件的响应非常重要。将葡萄糖中培养的表达WT和突变SOD1的酵母细胞转化为甘油培养基培养3小时。通过DHE染色分析细胞超氧化物。比例尺，10µm。（D） 图4C结果的量化（N>100）。（E） 将葡萄糖培养基中表达WT和突变SOD1的细胞从葡萄糖培养基转变为甘油培养基并培养3小时。用γ-H2AX抗体（绿色）IF分析DNA氧化损伤。DAPI（蓝色）显示细胞核。D、 葡萄糖；G、 甘油。（F） 图4E中结果的量化。数据表示三个独立实验的平均值±S.D.。*p<0.05，学生t吨-测试。比例尺，10µm。另请参见图S2。
图5
图5。mTORC1通过T40磷酸化调节人SOD1活性
（A） 雷帕霉素激活人体细胞内源性SOD1活性。用10nM雷帕霉素处理HEK293T、Hep3B、A549和MCF7细胞不同时间。分别用凝胶内试验和免疫印迹法测定SOD1活性和蛋白表达。下部面板显示SOD1活动相对于时间0的量化。（平均值±S.D.，n=3，*p<0.05，学生t吨-测试）。（B） mTORC1调节内源性SOD1的磷酸化。用10nM雷帕霉素处理Hep3B细胞，通过2D凝胶电泳和免疫印迹分析内源性SOD1蛋白。底部面板显示用小牛肠磷酸酶（CIP）处理的SOD1样品（0分钟）。（C） 酵母SOD1的3D蛋白质结构（顶部）、人SOD1（中部）和合并图像（底部）。箭头表示S39在SOD1中的重叠位置，T40在SOD1。（D，E）mTORC1调节SOD1-GFP（D）和SOD1-Flag（E）的磷酸化。用2D凝胶电泳和免疫印迹分析经雷帕霉素处理或不经雷帕霉素处理的Hep3B细胞中表达的WT和突变SOD1-GFP或SOD1-Flag。（F） SOD1的活性重量-GFP、SOD1T40A型-GFP和SOD1第40页-凝胶内SOD测定Hep3B细胞中GFP的表达。右侧面板显示了结果的量化（平均值±S.D.；n=3，*p<0.05，Student’St吨-测试）。（G） mTORC1通过T40磷酸化调节SOD1活性。瞬时表达SOD1的Hep3B细胞重量-GFP、SOD1T40A型-GFP或SOD1T40E型-使用或不使用10 nM雷帕霉素治疗GFP 1小时。用凝胶内hSOD法测定SOD1活性。免疫印迹法检测SOD1-GFP的表达。右侧面板显示了结果的量化（平均值±S.D.；n=3，*p<0.05，学生t吨-测试）。另请参见图S3。
图6
图6。mTORC1依赖性调节SOD1对减轻缺血环境中人类细胞的氧化DNA损伤至关重要
（A） SOD1被缺血环境激活。Hep3B细胞在缺血条件下（1%氧气和负葡萄糖）暴露不同时间。通过凝胶内分析和免疫印迹检测SOD1、SOD2和mTORC1信号的活性。右侧面板显示SOD1和SOD2活性以及P-S6K1（T389）的定量（平均值±S.D.，N=3，*P<0.05，学生t吨-测试）。HIF1a和p-AMPK作为缺血标志物。（B） 缺血状态以T40依赖的方式激活SOD1。瞬时表达SOD1的Hep3B细胞重量-GFP、SOD1T40A型-GFP和SOD1T40E型-GFP蛋白缺血3小时。SOD1-GFP活性和表达分别通过凝胶内试验和免疫印迹测定。底部，SOD1活性定量（平均值±S.D.，N=3，*p<0.05，学生t吨-测试）。（C） mTORC1对SOD1的调节对癌细胞在缺血环境中的存活至关重要。在正常或缺血条件下（−/+N-乙酰半胱氨酸，NAC）稳定表达WT和突变SOD1的Hep3B细胞在24小时后通过台盼蓝染色检测细胞死亡。数据表示平均值±S.D.（N=3，*p<0.05，Student’St吨-测试）。（D） 野生型和突变体SOD1在缺血环境中对DNA氧化损伤的保护作用。稳定表达SOD1的Hep3B细胞重量-GFP、SOD1T40A型-GFP和SOD1T40E型-GFP蛋白受到缺血3小时，并通过8-OxoG抗体免疫荧光染色分析氧化DNA损伤。比例尺，20µm。（E） 图6D中结果的量化。数据代表平均值±S.D.（N=3，*p<0.05，学生t吨-测试）。（F） WT和突变SOD1对缺血环境中DNA损伤的保护作用。稳定表达SOD1的Hep3B细胞重量-GFP、SOD1第40页-GFP和SOD1T40E型-GFP蛋白缺血3小时，用p-H2A免疫荧光染色分析DNA损伤。X（S139）特异性抗体。作为DNA损伤的阳性对照，Hep3B细胞被不同浓度的H2O（运行）220分钟。标尺，20µm。（G） 图6F中结果的量化。数据代表平均值±S.D.（N=3，*p<0.05，学生t吨-测试）。另请参见图S4和S5。
图7
图7。mTORC1对SOD1的依赖性调节对癌细胞在缺血环境中的生存和肿瘤生长至关重要
（A） SOD1的激活促进肿瘤球体的形成。在悬浮培养中检测稳定表达WT和突变SOD1-GFP蛋白的Hep3B细胞的球形形成。量化了三种典型的肿瘤球体形态：A，完整的肿瘤球体；B、 部分成熟肿瘤球体；C、 未成熟肿瘤球体。数据表示三个独立实验的平均值±S.D.（每个实验中N=18，*p<0.05）。（B） SOD1的激活降低了肿瘤球体中的ROS水平。将稳定表达不同SOD1-GFP蛋白的Hep3B细胞衍生的肿瘤球体（绿色）进行DHE染色（红色）。所示为典型的共焦显微图像。放大方框区域以显示更详细的DHE染色。比例尺，100µm。（C） DHE染色结果的量化。数据表示三个独立实验（双尾）的平均值±S.Dt吨-测试）。（D） SOD1的激活可减少肿瘤球体中的癌细胞死亡。通过丙二碘（PI）染色（红色）分析稳定表达不同SOD1-GFP蛋白（绿色）的Hep3B细胞产生的肿瘤球体的细胞死亡情况。所示为典型的共焦显微图像。比例尺，100µm。（E） PI染色结果的量化。数据表示三个独立实验（双尾）的平均值±S.Dt吨-测试）。（F） SOD1的激活促进异种移植瘤的生长。检测稳定表达不同SOD1-GFP蛋白的Hep3B细胞在裸鼠体内异种移植瘤生长。（G，H）显示的是研究结束时的肿瘤图像和重量（平均值±S.D，N=6，***p<0.05，Student’St吨-测试）。（一） Hep3B异种移植瘤切片中有代表性的γH2AX免疫荧光染色（红色）图像。肿瘤细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺，20µm。另请参见图S6。
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