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.2018年5月1日；9(5):505.
doi:10.1038/s41419-018-0564-3。

MiR-422a通过靶向丙酮酸脱氢酶激酶2调节胃癌细胞代谢和恶性肿瘤

中原河 1, 郑丽 1, 张宣 1, 凯因 1 2, 王伟志 1, 徐志鹏 1, 李博文 1, 张磊（Lei Zhang） 1, 徐江浩 1, 孙广利 1, 卢旺（Lu Wang） 1, 李青（音） 1, 黄晓旭 1, 陆章 1, 张殿才 1, 郝旭 1, 徐泽宽 三 4
附属公司

MiR-422a通过靶向丙酮酸脱氢酶激酶2调节胃癌细胞代谢和恶性肿瘤

中原河等。 细胞死亡病. .

摘要

越来越多的证据表明，microRNAs（miRNAs）的失调在人类恶性肿瘤中起着至关重要的作用。在此，我们发现与正常对照组相比，胃癌（GC）样本和细胞系中microRNA-422a（miR-422a）的表达显著下调，其表达水平与肿瘤大小和浸润深度呈负相关。功能研究表明，miR-422a在GC肿瘤细胞中的过度表达抑制了细胞增殖和迁移，并促使代谢从需氧糖酵解转变为氧化磷酸化。机理分析表明，miR-422a抑制丙酮酸脱氢酶激酶2（PDK2）以恢复丙酮酸酶脱氢酶（PDH）的活性，PDH是催化丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A的门控酶。重要的是，我们进一步证明了mir-422a-PDK2轴也影响了另一种代谢途径，即癌细胞中的从头脂肪生成，并随后影响了活性氧物种（ROS）和RB磷酸化水平，最终导致细胞周期阻滞在G1期。我们的研究结果表明，miR-422a-PDK2轴是代谢重编程的重要介体，也是抗肿瘤治疗的一个有希望的治疗靶点。

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数字

图1
图1。miR-422a在胃癌中的表达经常下调，并受表观遗传事件的调节。
一qRT-PCR分析胃癌组织和匹配的非癌胃粘膜组织中miR-422a的表达水平。b条miR-422a表达的典型FISH图像。比例尺，50 微米。c（c）比较TCGA和GEO数据库中GC组织和正常胃粘膜组织中miR-422a的表达。d日TCGA数据库中miR-422a高或低表达患者的总体生存分析。电子qRT-PCR分析所有六种GC细胞系和正常人胃上皮细胞系GES-1中miR-422a的表达。单向方差分析和Dunnett的多重比较测试。（f）与2.5孵育后 μM 5-aza-2′-脱氧胞苷（5-aza）72 h或100 12纳克/毫升曲古菌素A（TSA） h、 通过RT-PCR测定SGC7901细胞中pri-miR-422a、pre-miR-412a和成熟miR-422b的相对表达水平。GAPDH或U6分别用于pri-/pre-miR-422a和成熟miR-422a.的归一化。误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
图2
图2。miR-422a的体外和体内功能分析。
一使用Edu掺入法测量GC细胞中的DNA合成。红色荧光代表Edu阳性细胞；Hoechst染色的蓝色荧光代表细胞总数。b条进行Transwell分析以评估miR-422a对细胞迁移的影响。在显微镜下对五个随机选择的区域中的细胞进行计数。c（c）在携带来源于SGC7901和MGC803细胞的肿瘤的异种移植小鼠模型中评估miR-422a的体内作用；n个 = 每组6个。d日原发性肿瘤组织的代表性Ki67染色。比例尺：50 微米。电子通过侧尾静脉给予SGC7901和MGC803细胞的小鼠的生物发光图像。28天后拍摄图像。n个 = 每组6个。（f）腹腔注射GC细胞28天后小鼠转移瘤的生物发光图像。n个 = 每组6个。误差条代表平均值(n个 = 3) ± 标准偏差*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
图3
图3。miR-422a对葡萄糖代谢的影响分析。
一在指定的时间点（第0天和第2天）测量培养基的pH值。b条采用流式细胞术和比色法分别测定GC细胞株的乳酸、ATP生成和葡萄糖摄取分析。c（c）miR-422a敲除后过度表达SGC7901细胞（左）和MGC803细胞（右）的细胞外酸化率分析。葡萄糖处理后的细胞外酸化率表明糖酵解速率。寡霉素处理后的细胞外酸化率表明了糖酵解能力。d日miR-422a过表达的SGC7901细胞（左）和miR-422a敲低的MGC803细胞（右）的耗氧率分析。寡霉素治疗前的耗氧量表明基础呼吸率。FCCP处理后的耗氧量表示最大呼吸速率。误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01与相应NC
图4
图4。在GC中将PDK2鉴定为miR-422a靶点。
一SGC7901细胞中miR-422a过度表达后五个候选基因的qRT-PCR分析。b条miR-422a靶向位点位于靶基因的3′-UTR和相应突变。c（c）荧光素酶报告基因测定用于评估miR-422a与SGC7901细胞中候选基因靶向位点之间的相互作用。d日miR-422a过度表达或敲除的癌细胞中PDK2、总PDH和磷酸化PDH-E1α蛋白的水平。电子在SGC7901中的miR-422a过度表达和MGC803细胞中的miR422a敲低后，采集细胞以测量细胞PDH活性。（f）基于KM-plotter数据库中PDK2和PDH表达的患者总体生存分析。误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
图5
图5。PDK2对肿瘤生长和糖代谢的影响分析。
一用Edu掺入法测定GC细胞的DNA合成。红色荧光显示Edu阳性细胞；Hoechst染色的蓝色荧光代表细胞总数。b条在携带来源于SGC7901和MGC803细胞的肿瘤的异种小鼠模型中评估PDK2的体内作用；n个 = 每组6个。c（c）通过尾侧静脉给予SGC7901和MGC803细胞的小鼠的生物发光图像。28天后拍摄图像。n个 = 每组6个。d日腹腔注射GC细胞28天后小鼠转移瘤的生物发光图像。n个 = 每组6个。电子PDK2对葡萄糖代谢的影响分析。误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
图6
图6。miR-422a–PDK2轴对GC中ROS产生和细胞周期进展的影响分析。
一SGC7901细胞中miR-422a过度表达或PDK2敲除后ROS水平的FACS分析（上图）和统计结果（下图）。b条MGC803细胞中miR-422a敲除或PDK2过度表达后ROS水平的FACS分析（上图）和统计结果（下图）。c（c）转染Lv-miR-422a、sh-PDK2、阴性对照或10后SGC7901细胞的DNA含量分析 mM NAC用于24 h，如图所示。d日抗miR-422a、PDK2转染MGC803细胞后的DNA含量分析，阴性对照，20 μM或150 微米高2O（运行）224小时 h.误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
图7
图7。ROS抑制RB-E2F1通路。
一H（H）2O（运行）2治疗导致24小时内SGC7901和MGC803细胞磷酸化RB水平下降 小时。b条转染miR-422a、mock miR-422a、anti-miR-422 a、PDK2和sh-PDK2后，用western blotting检测E2F1、RB、p-RB、cyclin E1、c-myc和PCNA，并用20 微米高2O（运行）2或10 mM NAC，如图所示。c（c）用抗RB抗体或对照IgG对总蛋白提取物进行IP处理，然后用E2F1抗体进行western印迹。所有实验都重复了三次
图8
图8。miR-422a–PDK2轴通过从头开始的脂肪生成调节活性氧的产生。
一用Oil-Red-O染色法测定脂质生成。b条采用TAG检测试剂盒定量细胞TAG浓度。c（c）用2 mg/L卡蓝菌素或0.7 24小时的mol/L甘油 小时。d日GC中miR-422a–PDK2轴调控细胞代谢和恶性肿瘤的示意图。误差条代表平均值(n个 = 3) ± S.D.公司*P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001与相应NC
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