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.2018年4月6日；9(26):18309-18326.
doi:10.18632/目标24822。

内切酶G促进线粒体基因组切割和复制

拉赫尔·斯特凡妮·威赫 1, 鲍里斯·戈尔 1 2, 劳伦特·查特尔 三 4, 保罗-沃尔瑟 5, 恩里科·卡尔齐亚 6, 米莉娅·里切蒂 三 4, 丽莎·维斯米勒 1
附属公司

核酸内切酶G促进线粒体基因组分裂和复制

拉赫尔·斯特凡妮·威赫等。 Oncotarget公司. .

勘误表in

  • 更正：核酸内切酶G促进线粒体基因组分裂和复制。
    Wiehe RS、Gole B、Chatre L、Walther P、Calzia E、Palmer A、Gebhardt JCM、Ricchetti M、Wiesmüller L。 Wiehe RS等人。 Oncotarget公司。2018年6月12日；9(45):27908. doi:10.18632/目标25645。eCollection 2018年6月12日。 Oncotarget公司。2018 PMID：29963248 免费PMC文章。

摘要

内切酶G（Endonuclease G，EndoG）是一种核酸编码的内切酶，主要定位于线粒体。在细胞核内，EndoG参与复制应激过程中的定点切割和凋亡过程中的全基因组DNA降解。然而，EndoG对线粒体DNA（mtDNA）代谢的影响尚不清楚。在这里，我们研究了EndoG是否参与调节线粒体DNA复制和去除异常拷贝。我们将单细胞线粒体转录和复制成像协议（mTRIP）和基于PCR的策略应用于EndoG敲除/敲除和重新表达后的人类细胞。我们的分析表明，EndoG刺激mtDNA复制启动和mtDNA耗竭，这两个事件是相互关联的，并依赖于EndoG的核酸酶活性。EndoG刺激线粒体DNA复制独立于复制起点的7S DNA处理。重要的是，氧化应激促进了EndoG的mtDNA导向活性。抑制修复氧化应激诱导的DNA损伤的碱基切除修复（BER）揭示了EndoG对线粒体DNA去除的显著作用，令人想起最近在细胞核中发现的EndoG和BER之间的联系。除了对线粒体转录、蛋白质表达、氧化还原状态和形态的下游影响外，本研究还表明，EndoG去除受损线粒体DNA和代偿复制在线粒体稳态中起着关键作用。

关键词：基底切除修复；核酸内切酶G；线粒体DNA降解；氧化损伤。

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利益冲突声明

利益冲突作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。EndoG在线粒体O启动中的功能评估H（H）复制与线粒体转录
(A类)人类线粒体基因组的组织。用mTRIP标记FISH的mREP和mTRANS探针的识别位点分别用红色和绿色方框表示。HSP和LSP-重链和轻链启动子，OH（H）-重链复制的起源，NCR-非编码区（取自[7]）。(B类)HeLa细胞的典型共焦显微图像，用DAPI和MitoTracker DR染色（250-1000 nM，1 h），并在EndoG用siRNA敲除48 h后用mREP和mTRANS探针标记。比例尺=10μm。基于荧光的定量(C类)mREP（在O附近启动mtDNA复制H（H）)和(D类)线粒体转录；n个=来自2个独立实验的196–218个细胞。数据表示为平均值±SEM(****P（P）<0.0001; 未配对样本的非参数Mann-Whitney检验）。(E类)Western blot分析验证EndoG的高效敲除。
图2
图2。EndoG在7S DNA生成和转录调控中的潜在作用
HeLa细胞在葡萄糖培养基中培养，并转染对照nsRNA或靶向EndoG的siRNA（siEndoG），培养48 h(A类)上面板：NCR的示意图，包括D回路。H重链、L轻链、HSP和LSP重链和轻链启动子。CSB-保守序列块，TAS-终止相关序列，OH（H）-重链复制的起源。qPCR的引物位置用黑色箭头表示（参考：NC_012920.1，基因库）。使用相同的正向引物A和两个特异的反向引物B测定7S DNA和mtDNA含量。引物B1位于7S DNA内，而B2在7S DNA以外的下游结合更多（摘自[7]）。下面板：总基因组DNA的qPCR；12S mtDNA水平表示全长mtDNA含量，核编码的18S rRNA DNA水平作为数据正常化的内部控制。n个3-4个独立实验得出的=8-12；(B类)线粒体基因的RT-qPCR分析，这是mTRANS标记的靶点；核编码的TBP基因作为数据正常化的内部控制。n个=9来自3个独立实验；数据表示为平均值±SEM（ns，不显著；*P（P）<0.05;****P（P）<0.0001; 未配对样本的非参数Mann-Whitney检验）。
图3
图3。EndoG核酸酶和DNA结合活性对O启动调控的影响H（H）复制
左面板：转染空白对照质粒或表达EndoG-WT质粒的HAP1 EndoG敲除细胞的典型共焦显微图像(A类)催化失活的EndoG-H141A突变或(B类)EndoG-Δ结合突变体，培养48小时，随后用DAPI染色并用mREP探针标记。右侧面板：基于荧光的mREP标记量化。（A）n个=EndoG-WT与EndoG-H141A表达细胞的3个独立实验中的358–401个细胞；（B）n个=299–336来自EndoG-WT与EndoG-Δ结合突变体表达细胞的两个独立实验，EndoG-WG表达后出现增加；数据表示为平均值±SEM（ns，不显著；**P（P）<0.01,****P（P）<0.0001; 非配对样本的非参数Mann-Whitney检验）；比例尺=10μm。（C，D）Western blot分析验证不同EndoG变体蛋白的等效表达。注意，EndoG变体WT和H141A用Myc-DDK标签表达(C类)，而WT和Δ结合变体作为HaloTag®融合蛋白(D类)对于先导无肽线粒体蛋白，理论分子量分别为29kDa和62kDa。携带理论分子量为34kDa的先导肽的EndoG残余物可检测到Myc-DDK标记蛋白（C）。
图4
图4。EndoG在线粒体DNA降解中的作用
(A类)长程PCR Set1和Set2的引物对位置示意图，覆盖两个重叠片段中的整个线粒体基因组。Set1扩增10033 bp的片段，Set2扩增6910 bp的片段（在16569 bp的基因组上，NC_012920.1 GenBank）。(B类)上图：从生长在葡萄糖培养基中并用对照nsRNA或siEndoG转染的HeLa细胞中分离的总基因组DNA上进行长程PCR的琼脂糖凝胶电泳的代表性图像，随后培养48小时。下图：10kb Set1的定量(n个=5个在葡萄糖培养基中生长的Hela细胞和7 kb Set2的独立实验(n个=在葡萄糖或半乳糖培养基中培养的Hela细胞的6个独立实验中的12个，在长程PCR后mtDNA带强度。(C类)左面板：对转染了对照质粒或表达EndoG-WT的质粒或催化失活的EndoG-H141A突变体48小时的HAP1-EndoG敲除细胞分离的总基因组DNA进行长程PCR的琼脂糖凝胶电泳的代表性图像，以相同的曝光时间获得。右侧面板：Set2 mtDNA带定量；n个=8个独立实验显示EndoG-WT表达后减少。数据表示为平均值±SEM（ns，不显著；*P（P）<0.05; Wilcoxon配对符号秩检验）。
图5
图5。ROS诱导的氧化应激对EndoG启动线粒体DNA O功能的影响H（H）复制和线粒体DNA降解
(A类)哺乳动物细胞能量代谢途径的图示。左图：生长在葡萄糖培养基中的细胞通过OXPHOS以及通过糖酵解代谢葡萄糖产生ATP。右图：半乳糖培养基引导细胞进行谷氨酰胺代谢，并增强OXPHOS的活性以生成ATP，而不是使用糖酵解，这是ROS生成增加的结果（摘自[47]）。(B类)基于荧光的mREP标记量化（线粒体O的启动H（H）复制）在葡萄糖或半乳糖培养基中培养72小时的HeLa细胞；n个=来自3个独立实验的166–228个细胞。(C类)半乳糖培养基中培养的HeLa细胞（72 h），转染对照nsRNA或siEndoG（48 h），并用NaOH（控制）或ROS/RNS清除剂MnTBAP（100μM）处理24 h，基于荧光的mREP标记定量；n个=214–225，来自3个独立实验。数据表示为平均值±SEM。（ns，不显著；****P（P）<0.0001; 未配对样本的非参数Mann-Whitney检验）。(D类)左图：从半乳糖培养基（72小时）中生长并用h处理的HeLa细胞中分离的总基因组DNA上的长程PCR的琼脂糖凝胶电泳的代表性图像2O（控制）或50μM H2O（运行）2持续5 h。右侧面板：Set2 mtDNA带定量；n个=2个独立实验；数据表示为平均值±SD。
图6
图6。EndoG对线粒体基因组复制、BER或融合相关因子表达的影响
HeLa细胞在半乳糖培养基中生长（72 h），并转染对照nsRNA或siEndoG，培养48 h(A类)左面板：POLγ表达的Western blot分析代表性图像；右侧面板：Western blot分析定量。n个=4个独立实验。（B–F）代表性免疫荧光显微图像（左侧面板）和基于荧光的蛋白质定量（右侧面板）(B类)TWINKLE公司n个= 120, (C类)mtSSB公司n个= 110–127, (D类)APE1接口n个= 157–171, (E类)MFN2型n个=157–171或(F类)OPA1（作战行动1）n个=分别来自2个独立实验的103–141个细胞。数据表示为平均值±SEM（ns，不显著；*P（P）<0.05;****P（P）< 0.0001; 非配对样本的非参数Mann-Whitney检验）；比例尺=10μm。
图7
图7。EndoG介导mtDNA O诱导的模型H（H）复制启动
ROS水平升高，主要来源于线粒体ETC，由半乳糖代谢等提供，导致线粒体DNA氧化损伤。如果BER不能修复这种损伤，EndoG可能会发生解理反应。线粒体DNA的耗竭可能导致O的代偿性增加H（H）复制起始和下游线粒体活性如转录。
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