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.2018年8月;42(2):755-768.
doi:10.3892/ijmm.2018.3651。 Epub 2018年5月2日。

灯盏花素通过抑制炎症细胞凋亡反应和ROS生成改善CCl4诱导的小鼠肝损伤

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灯盏花素通过抑制炎症细胞凋亡反应和活性氧生成改善CCl4诱导的小鼠肝损伤

于柳等。 国际分子医学杂志. 2018年8月.

摘要

急性肝损伤的特点是纤维化、炎症和凋亡,导致肝衰竭、肝硬化或癌症,并影响长期临床结局。然而,目前尚无有效的治疗策略。灯盏花素是一种黄酮苷类化合物的混合物,据报道具有多种生物功能。本研究旨在探讨灯盏花素对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的影响。对C57BL/6小鼠进行CCl4腹腔注射,持续8周,注射或不注射灯盏花素(15或30 mg/kg)。经CCl4治疗的小鼠出现急性肝损伤,组织学分析、Masson三色和天狼星红染色证明,同时伴有丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高。此外,还观察到促炎细胞因子、趋化因子和凋亡因子(包括caspase‑3和聚(ADP核糖)聚合酶‑2(PARP‑2))的增加。灯盏花素治疗显著且剂量依赖性地减少胶原沉积和纤维化区域。灯盏花素通过失活Toll‑like receptor 4/nuclear factor-κB信号通路下调炎症细胞因子。此外,灯盏花素与CCl4联合给药通过提高B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)水平,同时降低Bcl-2相关的X蛋白、凋亡蛋白酶激活因子1、胱天蛋白酶-3和PARP活性,从而降低凋亡反应。此外,灯盏花素通过改善抗氧化剂和阻止丝裂原活化蛋白激酶途径来阻断CCl4诱导的氧化应激。本研究强调,灯盏花素通过抑制炎症和凋亡,对CCl4诱导的急性肝损伤具有肝保护作用。

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数字

图1
图1
灯盏花素改善CCl4-诱导小鼠肝脏组织学改变和胶原沉积。(A) 灯盏花素的化学结构。(B) 研究设计示意图。(C) CCl肝切片的组织学分析4-通过苏木精-伊红染色诱导小鼠,并进行组织学评分。(D) 对胶原的沉积进行了Masson分析。(E) 苦味酸-虹彩红染色法测定胶原积累。显示具有代表性的图像和量化。比例尺,100µm.平均值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)**P<0.01和***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组。
图2
图2
灯盏花素减轻CCl诱导的小鼠肝损伤4(A)检测小鼠血清中的ALT、(B)AST和(C)白蛋白水平,以评估灯盏花素在调节CCl诱导的肝损伤中的作用4(D)评估肝脏羟脯氨酸水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。***与对照组相比,P<0.001;++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组;丙氨酸氨基转移酶;天冬氨酸转氨酶。
图3
图3
灯盏花素改善CCl4-通过减少促炎细胞因子的分泌来诱导肝损伤。(A) 用ELISA试剂盒检测血清促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1趋化因子。(B) 使用商业ELISA试剂盒测定肝脏促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β以及趋化因子MCP-1。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。**与Con相比,P<0.01和***P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组;肿瘤坏死因子;白细胞介素;MCP,单核细胞趋化蛋白。
图4
图4
灯盏花素改善CCl4-通过抑制TLR4/NF-κB信号传导诱导肝损伤。(A) 采用免疫荧光显微镜观察CCl后小鼠肝脏切片中TLR4的强度4归纳。比例尺,100µm(B)TLR4和MyD88蛋白水平通过western blot分析计算,并用代表性图像和定量水平显示。(C) 免疫印迹分析测定磷酸化IKKα、IκBα和NF-κB水平。还显示了量化水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组;TLR,Toll样受体;p-NF-κB,磷酸化核因子κB;IκBα,NF-κB抑制剂;IKKα、IκB激酶α;MyD88,髓系分化初级反应基因88。
图5
图5
灯盏花素通过抑制CCl细胞凋亡减轻肝损伤4-诱导小鼠。(A) 采用免疫组织化学方法评估不同处理组小鼠肝脏切片中Bax的水平。比例尺,100µ用western blot分析评估m.(B)Bax和Bcl-2蛋白水平。显示了Bax和Bcl-2的定量水平,并显示了Bax/Bcl-2的比率。(C) 通过蛋白质印迹分析测定活性胱天蛋白酶-3和PARP-1蛋白的丰度。显示蛋白质的代表性印迹图像,并伴有定量水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组;Bcl-2、B细胞淋巴瘤-2;Bax,Bcl-2相关X蛋白;PARP,聚ADP核糖聚合酶。
图6
图6
灯盏花素减少CCl治疗小鼠肝脏凋亡4(A)TUNEL分析用于评估CCl的凋亡4-灯盏花素诱导小鼠肝脏。比例尺,100µm(B)计算小鼠肝切片中Apaf-1阳性细胞数。比例尺,100µm.数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组;凋亡蛋白酶激活因子1;TUNEL,末端脱氧核苷酸转移酶脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记。
图7
图7
灯盏花素降低CCl诱导的小鼠肝脏氧化应激4(A)肝脏SOD活性、GSH水平、MDA水平和H22测量水平。(B) Western blot分析用于测定肝组织样本中SOD1、NQO-1、HO-1和Nrf2蛋白的表达水平。(C) 使用western blot分析计算肝脏样本中的p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=8)。**P<0.01和***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与CCl相比P<0.0014-诱导小鼠。型号,CCl4-治疗组;Con,对照组。超氧化物歧化酶;谷胱甘肽合酶;MDA、丙二醛;血红素加氧酶1;NQO-1,NAD(P)H醌脱氢酶1;p-ERK,磷酸化细胞外信号调节激酶;JNK,c-Jun N-末端激酶;核因子红细胞2相关因子2。
图8
图8
灯盏花素抑制LPS刺激L02细胞的炎症反应在体外(A)用不同浓度(0、5、10、20和40)的灯盏花素处理L02、BRL-3A和AML-12正常肝细胞系µM) 在0-72小时的不同时间内,通过细胞计数试剂盒-8测定细胞活力,以评估灯盏花素对肝细胞的细胞毒性。此外,L02细胞在没有或存在灯盏花素(20或40)的情况下暴露于100 ng/ml LPS中24小时µM) ●●●●。(B) 通过逆转录定量聚合酶链反应分析评估促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18以及趋化因子MCP-1。(C) Western blot分析评价不同处理后L02细胞TLR4和MyD88的水平。(D) 免疫印迹分析检测IKKα、IκBα和NF-κB(p65)磷酸化。提供了具有代表性的蛋白质印迹图像和定量蛋白质水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=8)。*P<0.05,**P<0.01和***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与LPS组相比,P<0.001。脂多糖;Con,对照组;p-NF-κB,磷酸化核因子κB;IκBα,NF-κB抑制剂;IKKα、IκB激酶α;TLR,Toll样受体;MyD88,髓系分化初级反应基因88;肿瘤坏死因子;白细胞介素;MCP,单核细胞趋化蛋白。
图9
图9
灯盏花素减少LPS诱导的L02细胞凋亡。(A) 采用逆转录定量聚合酶链反应分析,测定在有或无灯盏花素的情况下,LPS处理的L02细胞中Bcl-2、Bax和Apaf-1的水平。(B) Western blot分析检测Bcl-2、Bax和Apaf-1在蛋白水平的表达。提供了具有代表性的蛋白质印迹图像和定量蛋白质水平。(C) 用免疫荧光分析法检测L02细胞中Apaf-1阳性细胞,L02细胞暴露于经或不经灯盏花素处理(20或40µM) ●●●●。比例尺,50µm.(D)活性caspase-3和PARP蛋白水平通过western blot分析进行评估。提供了代表性的蛋白质印迹图像和定量的蛋白质水平。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。**P<0.01和***与对照组相比,P<0.001;+P<0.05,++P<0.01和+++与LPS组相比,P<0.001。控制;Bcl-2;B细胞淋巴瘤-2;Bax,Bcl-2相关X蛋白;聚ADP核糖聚合酶;凋亡蛋白酶激活因子1;脂多糖。
图10
图10
灯盏花素下调LPS诱导的L02细胞氧化应激。(A) 采用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯法检测LPS处理L02细胞(20或40)后活性氧的生成µM) ●●●●。比例尺,50µm.(B)SOD1、NQO-1、HO-1和Nrf2,以及(C)p-p38、p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平用western blot分析测定。量化结果显示在条形图中。数值表示为平均值的平均值±标准误差(n=10)。***与对照组相比,P<0.001。+P<0.05,++P<0.01和+++与LPS组相比,P<0.001。控制;脂多糖;超氧化物歧化酶;血红素加氧酶1;NQO-1,NAD(P)H醌脱氢酶1;p-ERK,磷酸化细胞外信号调节激酶;JNK,c-Jun N末端激酶;Nrf2,核因子红系2相关因子2。

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