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.2018年4月27日；9(1):1685.
doi:10.1038/s41467-018-03966-7。

蜗牛通过CXCR2配体上调招募髓源性抑制细胞促进卵巢癌进展

马纳塔基 1, 高茹·阿比科 2, Tsukasa Baba公司 1, 滨崎骏（Junzo Hamanishi） 1, Ken Yamaguchi山口健 1, 村上隆 1, 山野Koji Yamanoi 1, 直木浩川 1, 胡索育子 1, 中村英二 三, 杉山爱子 三, Masaki Mandai公司 1, Ikuo Konishi先生 1, 松本正木 1
附属公司

蜗牛通过上调CXCR2配体募集髓系抑制细胞，促进卵巢癌进展

马纳塔基等。 国家通讯社. .

摘要

蜗牛是诱导上皮-间充质转化（EMT）的主要转录因子。在本研究中，我们探讨了蜗牛对肿瘤免疫的影响。小鼠卵巢癌细胞中的蜗牛敲除抑制免疫活性小鼠的肿瘤生长，与CD8增加相关+肿瘤浸润性淋巴细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）的减少。蜗牛敲除降低CXCR2配体（CXCL1和CXCL2）的表达，CXCR2是一种通过CXCR2将MDSC吸引到肿瘤的趋化因子。蜗牛通过NF-kB途径上调CXCR配体，最有可能的是通过与启动子的直接结合。CXCR2拮抗剂抑制表达蜗牛的小鼠肿瘤中MDSC的浸润并延缓肿瘤生长。卵巢癌患者血清CXCL1/2升高，这与蜗牛表达、MDSC浸润和总生存期短有关。因此，蜗牛通过上调CXCR2配体和招募MDSC诱导癌症进展。阻断CXCR2是一种免疫治疗方法，可以抑制接受EMT的蜗牛高肿瘤的进展。

PubMed免责声明

利益冲突声明

E.N.参与了这项研究，作为由住友大日本制药有限公司赞助的京都大学医学创新中心DSK项目的受赠副教授之外的工作。其余作者声明没有竞争利益。

数字

图1
图1
蜗牛的表达与卵巢癌上皮-间质转化和预后不良有关。一来自TCGA数据集的266例高级浆液性卵巢癌（HGSOC）样本的一般上皮-间充质转化（EMT）评分与蜗牛表达的相关性。EMT特征由Tan等人从之前的报告中获得。根据单样本基因集富集分析（ssGSEA）方法计算一般EMT得分。相关系数(R（右）)和对-价值基于皮尔逊的产品-时刻相关性分析；R（右） = 0.41对 < 0.0001.b条TCGA数据集中代表四种亚型的HGSOC样本中蜗牛的表达***对 < 0.001和****对 < 0.0001，间充质细胞与其他三种亚型，基于Tukey多重比较测试的单向方差分析。棒材：平均值和SEM。c（c）根据核蜗牛免疫染色强度确定的HGSOC分类。得分为0/1的患者被分配到蜗牛低体重组，而得分为2/3的患者被分到蜗牛高体重组，用于生存分析。比例尺，100 微米。d日京都大学医院HGSOC患者的总体生存曲线(n个 = 56; 48例III期和8例IV期），基于网膜播散性肿瘤的蜗牛染色。对 = 通过对数库测试为0.021
图2
图2
蜗牛抑制肿瘤进展并与肿瘤免疫相关。一HM-1-对照细胞和HM-1-shSnail细胞的Western blot。CDH1：E-Cadherin，VIM vimentin。b条HM-1-对照细胞和HM-1-shSnail细胞的侵袭；n个 = 5c（c）HM-1-对照细胞和HM-1-shSnail细胞的伤口愈合。数据表示缠绕宽度的百分比（24 h） 相对于0时的 h；n个 = 6d日HM-1-对照和HM-1-shSnail皮下肿瘤在免疫活性小鼠中的生长曲线。对-数值表示第31天两组之间的显著性；n个 = 6e（电子）免疫缺陷裸鼠皮下肿瘤HM-1-对照和HM-1-shSnail的生长曲线；n个 = 6; 在第23天，两组之间NS无显著差异*对 < 0.05, **对 < 0.01，以及***对 < 0.001（使用Tukey多重比较测试的单向方差分析b条–e（电子）). 平均数据表示为平均值 ± 扫描电镜
图3
图3
蜗牛与肿瘤内髓源性抑制细胞增加有关。一来自免疫活性小鼠的HM-1-对照和HM-1-shSnail（sh1）皮下肿瘤的免疫染色细胞计数。高功率场；n个 = 5-6.CD8+（左），组-1+（中间）和CD11b+（右）。b条来自免疫活性小鼠的HM-1-对照和HM-1-shSnail（sh1）皮下肿瘤的流式细胞术。绘制阳性细胞的百分比；n个 = 6、CD8+（左；CD3+CD4细胞−CD8（CD8）+)，细胞内IFNγ（中间；IFNγCD3+CD8（CD8）+)，和MDSC（右；CD45+等级-1+CD11b型+).c（c）显示CD33表达（人类MDSC标志物）在人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）腹膜播散中的代表性图像。比例尺，100 微米。d日CD33浸润的相关性+网膜相应播散性肿瘤中的细胞和蜗牛表达(R（右） = 0.35,对 = 0.0082）；n个 = 56; 皮尔逊的产品-时刻相关性分析*对 < 0.05, **对 < 0.01，以及***对 < 0.001（未配对t吨-在中测试一和b条). 平均数据表示为平均值 ± 扫描电镜
图4
图4
CXCR2配体在Snail高卵巢肿瘤中高度表达。一HM-1对照DNA微阵列数据的GO（基因本体）术语分析(n个 = 3） 和HM-1-shSnail（sh1；n个 = 2和sh2；n个 = 2） 单元格。显著下调的基因用于GO术语分析。补充表2中列出了基因。b条蜗牛的表达与CXCR2配体（CXCL1；左上角，对 < 0.0001，CXCL2；右上角，对 < 0.001和CXCL5；左下方，对 < 0.05）在TCGA样品中(n个 = 266). 皮尔逊的产品-时刻相关性分析。c（c）人卵巢癌细胞系、OVCAR8和OVCAR8-shSnail（左）以及OVCA433和OVCA433-Snail（右）的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）；n个 = 4d日,e（电子）人卵巢癌细胞系细胞上清液ELISA，d日OVCAR8和OVCAR8-shSnail，以及e（电子）OVCA433和OVCA433-蜗牛；n个 = 6（f）HM-1-对照细胞和HM-1-shSnail细胞的RT-PCR；n个 = 5克,小时皮下肿瘤中CXCL1、CXCL2和CXCL5的水平(克)在血液中(小时)取自HM-1-对照和HM-1-shSnail肿瘤小鼠；n个 = 6. *对 < 0.05, **对 < 0.01，以及***对 < 0.001（未配对t吨-在中测试c（c）–e（电子）,克,小时; 使用Tukey多重比较测试的单向方差分析（f）). 平均数据表示为平均值 ± 扫描电镜
图5
图5
蜗牛通过NF-κB途径诱导CXCL1和CXCL2，并可能通过与它们的启动子的直接结合。一核蜗牛、HM-1、OVCAR8和OVCA433细胞的磷酸化p65（phospho-p65）、p65和RelB的蛋白质印迹。对照组为HDAC1。b条逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析Cxcl1公司和Cxcl2公司HM-1对照细胞和HM-1-shSnail细胞（左）中CXCL1系列和CXCL2系列在OVCAR8对照和OVCAR8 shSnail细胞（右）中，在10 24μM h；n个 = 4c（c）的示意图CXCL1系列和CXCL2系列启动子组织，相应的荧光素酶报告子构建pGL-CXCL1（1523 bp：−1523至+110 基点，984 bp：−984至+110 基点，300 bp：−300至+110 bp）和pGL-CXCL2（1606bp:-1606至+104 基点，942 bp：−942至+104 基点，457 bp：−457至+104 bp）。TSS转录起始位点、E1外显子1和Luc荧光素酶。黑色条表示E-box（CANNTG），这是蜗牛的结合位点。d日荧光素酶报告子分析293FT对照细胞和293FT-shSnail细胞中pGL-CXCL1和pGL-CXCL2启动子结构的活性。显示了相对荧光素酶活性；n个 = 5. *对 < 0.05, **对 < 0.01，以及***对 < 0.001（使用Tukey多重比较测试的单向方差分析b条; 未成对的t吨-在中测试d日). 平均数据表示为平均值 ± 扫描电镜
图6
图6
CXCR2配体诱导髓源性抑制细胞浸润。一HM-1荷瘤小鼠皮下肿瘤MDSC对CXCL1、CXCL2和CXCL5的趋化作用；n个 = 4b条预处理SB265610（CXCR2拮抗剂）的HM-1荷瘤小鼠皮下肿瘤MDSC在每个CXCR2配体存在的情况下（100 纳克/毫升）；n个 = 4c（c）人卵巢癌腹水MDSC对CXCL1、CXCL2和CXCL5的趋化反应。显示趋化性指数；n个 = 4d日不同浓度SB265610处理的人骨髓增生异常综合征细胞在CXCR2配体存在下的趋化反应；n个 = 4. *对 < 0.05, **对 < 0.01，以及***对 < 0.001（使用Tukey多重比较测试的单向方差分析一–d日)
图7
图7
CXCR2拮抗剂通过蜗牛抑制肿瘤进展。一皮下注射HM-1-对照细胞或HM-1-shSnail细胞并用抗Ly6G抗体（400 µg/体）或IgG，从接种肿瘤后第1天起每周两次。对-数值代表第19天两组之间的显著性；n个 = 5–6.b条第19天用抗Ly6G抗体或IgG治疗的皮下HM-1对照肿瘤的流式细胞术分析。绘制阳性细胞相对于总细胞的百分比。MDSC（左）和CD8+T细胞/MDSC（右）；n个 = 6c（c）第19天用抗Ly6G抗体或IgG治疗的皮下HM-1-shSnail肿瘤的流式细胞术分析。绘制阳性细胞相对于总细胞数的百分比。MDSC（左）和CD8+T细胞/MDSC（右）；n个 = 5–6.d日皮下注射HM-1-对照细胞或HM-1-shSnail细胞并用SB265610（2 mg/kg体重）或PBS，从接种肿瘤后第1天开始每周六次。对-数值在第21天代表两组之间的显著性；n个 = 4–6.e（电子）第21天用SB265610或PBS治疗的皮下HM-1对照肿瘤的流式细胞术分析。绘制阳性细胞相对于总细胞的百分比。MDSC（左）和CD8+T细胞/MDSC（右）；n个 = 5-6.（f）第21天用SB265610或PBS治疗的皮下HM-1-shSnail肿瘤的流式细胞术分析。绘制阳性细胞相对于总细胞数的百分比。MDSC（左）和CD8+T细胞/MDSC（右）；n个 = 4–5. *对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.001（未配对t吨-在中测试一–（f）)
图8
图8
血清CXCL1和CXCL2水平升高反映肿瘤内MDSC，并与卵巢癌患者预后不良相关。一卵巢癌患者血清CXCL1（左）和CXCL2（右）的浓度(n个 = 26）与健康捐赠者的对比(n个 = 8); 意思是 ± 扫描电镜***对 < 0.001（未配对）t吨-测试。b条卵巢癌患者血清CXCL1和CXCL2浓度的相关性(n个 = 26);对 = 0.0002,R（右） = 0.67. 皮尔逊的产品-时刻相关性分析。c（c）血清CXCL1的相关性（左；对 = 0.018）和CXCL2（右侧；对 = 0.09）CD33的水平和渗透+腹膜播散细胞；n个 = 12; 皮尔逊的产品-时刻相关性分析。d日血清CXCL1的相关性（左；对 = 0.049）和CXCL2（右侧；对 = 0.080）水平和蜗牛染色得分；n个 = 12; 皮尔逊的产品-时刻相关性分析。e（电子）卵巢癌患者的总体生存率，与高血清CXCL1组相比(n个 = 12） 低血清CXCL1组(n个 = 14). 截止水平，42.83 pg/ml；AUC公司 = 0.6842. 危害比15.08；95%置信区间（CI），3.859-102.9；对 = 通过log-rank测试得出0.0005。（f）卵巢癌患者的总体生存率，与高血清CXCL2组相比(n个 = 13） 低血清CXCL2组(n个 = 13). 截止水平，93.57 pg/ml；AUC公司 = 0.6767. 危害比13.87；95%置信区间（CI），3.56–89.72；对 = 对数秩检验0.0008
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