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.2018年4月27日；15(1):79.
doi:10.1186/s12985-018-0989-4。

寨卡病毒诱导的小鼠初级神经元死亡前的过度兴奋

朱莉·加布罗 1 2, 阿西姆·巴蒂 2, 维诺德·桑达拉穆斯 1, 梅根·迪恩利 1, 黛安·格林 1, 赛义德·纳哈瓦迪 2, 普拉萨德·N·帕拉德卡 1, Jean-Bernard Duchemin（吉恩·伯纳德·杜奇曼） 三
附属公司

寨卡病毒诱导的小鼠初级神经元死亡前的过度兴奋

朱莉·加布罗等。 维拉尔J. .

摘要

背景：新生儿中的寨卡病毒感染与先天性综合征，尤其是小头畸形有关。研究表明，这些神经病变是胚胎中枢神经系统中的神经祖细胞显著死亡的结果，这些神经祖细胞被病毒攻击。虽然通过凋亡导致的细胞死亡已被广泛承认，但对触发神经元细胞死亡的可能致病细胞机制知之甚少。

方法：我们使用体外胚胎小鼠原代神经元培养物来研究细胞死亡的可能上游细胞机制。在微电极阵列上生长神经网络，记录寨卡病毒感染后不同时间的电活动。除此方法外，我们还使用共焦显微镜和Q-PCR技术观察感染后的形态和分子变化。

结果：小鼠初级神经元的寨卡病毒感染会触发神经元培养物的早期尖峰兴奋，随后这种活性会急剧丧失。使用NMDA受体拮抗剂，我们表明这种可能通过谷氨酸的兴奋性毒性机制也可能导致人类胚胎中观察到的神经系统缺陷，并可能为成人神经病变的病因开辟新的视角。

结论：在嗜神经病毒感染的背景下，这种兴奋毒性模型强调了微电极阵列记录神经元活动的重要性，以及寨卡病毒感染神经系统后可能存在多种致死机制。

关键词：兴奋性毒性；谷氨酸；超激励；微电极阵列；初级神经元；尖峰；齐卡。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

数字

图1
图1
小鼠胚胎初级神经元自发活动的电生理分析。一感染后不同天（dpi）微电极阵列（MEA）上神经元培养物5分钟峰值活性的光栅图。b条在小鼠原代神经元培养物的不同dpi下，自发神经元活动记录期间活动电极（AE）和破裂电极（BE）的百分比。c（c）小鼠自发尖峰放电活动，每电极总尖峰（TS）数的平均比率介于0 dpi（参考值）和自发活动2和7 dpi时的TS数之间。除非括号中注明，否则通过比较未感染组和感染组，使用未配对t检验计算统计差异*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 指±SEMc（c） n个值详见附加文件7：表S3
图2
图2
加巴静刺激7dpi时小鼠胚胎初级神经元的电生理分析。一用加巴静刺激和溶剂（水）引入之间每电极TS数的平均比率刺激小鼠初级神经元；n个 = 活动电极的数量。b条折线图表示不同时间点参考（TC水）和加巴静引入之间每个电极平均峰值数的平均相对变化。除非括号中注明，否则通过比较未感染组和感染组，使用未配对t检验计算统计差异*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 指±SEM。c（c）加巴静刺激小鼠神经网络2分钟，以饮水后为基线和加巴静后的3D电极活性图
图3
图3
寨卡病毒在1、2和3dpi的早期感染动力学。一寨卡病毒复制动力学（使用TCID50在Vero细胞中）感染后0至72小时在小鼠初级神经元中(n个 = 每种情况3个）。b条9 div（或2 dpi）未感染小鼠胚胎神经元培养的共焦图像。c（c）ZIKV（左）或DENV2（右）感染网络在1、2和3 dpi的共聚焦图像，显示神经元（绿色MAP2）和胶质细胞（绿色GFAP）中存在病毒（红色4G2）
图4
图4
寨卡病毒（ZIKV）从3 dpi开始对初级神经元网络产生影响。一代表性共焦图像，顶部显示DAPI标记（蓝色）、NeuN抗体（红色）和MAP2抗体（绿松石色），其对应图像下方显示MAP2染色。ImageJ软件的图像分析揭示了MAP2信号的差异。b条MAP2覆盖率的量化，通过小鼠初级神经元培养物中3 dpi时DAPI计数的数量进行标准化，n个值详见附加文件2：表S2。c（c）条形图比较了3 dpi时ZIKV感染细胞和未感染细胞的DAPI染色细胞核的大小。每个箱子以平方像素表示核的分布范围大小(n个 = 每种情况下5张图像）。条形图值显示为±平均标准误差（SEM）和Mann-Whitney第页-顶部的值*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001. 右边的共焦图片显示了3 dpi下的核尺寸
图5
图5
寨卡病毒（ZIKV）对7dpi初级神经元网络的影响。一顶部为ZIKV感染前（0 dpi）和感染后（7 dpi）小鼠原代神经元培养的共聚焦图像，底部为ImageJ应用图像阈值后的Synapsin信号。b条在小鼠原代神经元培养物中，0和7dpi时NeuN染色的成熟小鼠神经元的百分比。c（c）Synapsin I/II信号的量化，通过右侧的DAPI计数数量进行标准化。使用Mann-Whitney计算统计差异U型测试时，将0 dpi与其他组进行比较，除非括号中另有说明*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 指±SEM；n个值详见附加文件2：表S2
图6
图6
初级神经元培养中寨卡病毒感染后基因mRNA的表达。量化一谷氨酸转运蛋白（EEAT），b条谷氨酸脱氢酶（GD1），c（c）GABA公司A类运输公司（GAT1）和d日电压门控钠通道（VGNaC）mRNA表达。统计差异是用未配对计算的t吨-通过比较mRNA在时间上的表达进行测试我到时间我-1每组内(n个 = 3). *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 平均值±SEM
图7
图7
在小鼠原代神经元培养中引入NMDA-R拮抗剂后，以2 dpi的速度记录微电极阵列（MEA）。一引入NMDA-R拮抗剂APV后神经网络培养的平均活性电极百分比(n个多边环境协定 = 每种情况3个）。b条电极活性计算为APV和溶剂引入之间每个电极的总尖峰数（TS）的平均比率；曼·希特尼U型测试*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001; 指±SEM；n个 = 活性电极数量
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