Serotonin is an endogenous regulator of intestinal CYP1A1 via AhR

doi:10.1038/s41598-018-24213-5

.2018年4月17日；8(1):6103.

doi:10.1038/s41598-018-24213-5。

血清素是通过AhR调节肠道CYP1A1的内源性调节因子

克里斯托弗·曼泽拉¹, 梅加·辛格尔², Waddah A Alrefai河^2 三, Seema Saksena公司^2 三, Pradeep K Dudeja公司^2 三, Ravinder K Gill公司⁴

附属公司

¹美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学生理与生物物理系。
²美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学胃肠病学和肝病学系。
^三杰西·布朗VA医疗中心，美国伊利诺伊州芝加哥。
⁴美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学消化与肝脏科。rgill@uic.edu。

PMID： 29666456
预防性维修识别码：项目经理5904159
内政部： 10.1038/s41598-018-24213-5

血清素是通过AhR调节肠道CYP1A1的内源性调节因子

克里斯托弗·曼泽拉等。科学代表. 2018.

.2018年4月17日；8(1):6103.

doi:10.1038/s41598-018-24213-5。

作者

克里斯托弗·曼泽拉¹, 梅加·辛格尔², Waddah A Alrefai河^2 三, Seema Saksena公司^2 三, Pradeep K Dudeja公司^2 三, Ravinder K Gill公司⁴

附属公司

¹美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学生理与生物物理系。
²美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学胃肠病学和肝病学系。
^三杰西·布朗弗吉尼亚医疗中心，美国伊利诺伊州芝加哥。
⁴美国伊利诺伊州芝加哥伊利诺伊大学胃肠病学和肝病学系。rgill@uic.edu。

PMID： 29666456
预防性维修识别码：项目经理5904159
内政部： 10.1038/s41598-018-24213-5

摘要

芳基烃受体（AhR）是一种核受体，通过诱导细胞色素P450 1A1（CYP1A1）控制外源性解毒，并调节肠道免疫反应。L-色氨酸的代谢物激活AhR，从而保护肠道炎症。我们验证了以下假设：5-羟色胺（5-HT）是肠上皮细胞中AhR的内源性激活剂。用5-HT处理Caco-2单层以时间和浓度依赖的方式诱导CYP1A1 mRNA，并刺激CYP1A1mRNA活性。5-HT诱导的CYP1A1依赖于通过5-羟色胺转运体（SERT）的摄取。AhR的拮抗作用和AhR及其结合伙伴芳基烃受体核转运体（ARNT）的敲除减弱了5-HT对CYP1A1的诱导作用。通过5-HT处理后的核转位和AhR-反应荧光素酶报告子的诱导，AhR被激活。体内研究表明，通过微阵列分析，SERT KO回肠粘膜中CYP1A1表达和其他AhR靶基因显著减少。这些结果表明，5-HT通过SERT在细胞内的积累通过AhR诱导肠上皮细胞中CYP1A1的表达，而体内SERT缺乏会损害AhR的激活。我们的研究在血清素能和AhR途径之间提供了一种新的联系，这种联系在外源性代谢和肠道炎症中具有意义。

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数字

图1
5-HT通过转录机制诱导CYP1A1 mRNA表达和活性。在进行治疗之前，将Caco-2细胞低密度培养，并在含有20%血清的培养基中分化10-14天。(一)Caco-2细胞在浓度为10的无血清培养基中用5-HT处理 2μM 小时–24 小时(n个 = 3) (b条)或用于8 h，浓度范围为1 微米–100 微米(n个 = 3). 数据表示*CYP1A1公司*与时间匹配的未处理细胞相比，通过qPCR定量mRNA。(**c（c）**)Caco-2细胞用10 无血清培养基中的μM 5-HT和CYP1A1活性通过乙氧基再鲁芬-O-脱乙基酶（EROD）分析测定(n个 = 4). 使用三个重复的微孔对每个处理进行分析，并通过Bradford分析将数值归一化为总蛋白。结果表示为与时间匹配的未处理细胞活性的折叠变化。(d日)用载体（Con）或放线菌素D处理Caco-2细胞1 与5-HT联合治疗24小时前无血清培养基中的h(n个 = 3). 通过单向分析数据(一)或双向(b条——d日)方差分析后进行Tukey多重比较检验**P（P）* < 0.05, ****P（P）* < 0.001*****P（P）* < 0.0001 vs.无5-HT。^#*P（P）* < 0.05,^###*P（P）* < 0.001,^####*P（P）* < 组间0.001。红色圆圈 = 未经处理的蓝色方形 = 5-羟色胺。

图2
CYP1A1 mRNA的诱导独立于5-HTR和MAO，但依赖于SERT。在未转染的情况下进行治疗之前，将Caco-2细胞以低密度电镀，并在含有20%血清的培养基中分化10-14天(一,b条,**（f）**). 当进行转染时，从24小时开始处理Caco-2细胞 h后转染(**c（c）**——e）. (一)用载体（Con）或5-HTR拮抗剂托烷司琼或阿塞那平处理Caco-2细胞1 与5-HT联合治疗8小时前无血清培养基中的h(n个 = 3). (b条)用载体（Con）或氟西汀（1）处理Caco-2细胞在5-HT（10）联合治疗前，在含血清培养基中放置4天 μM）与氟西汀（1 μM）用于12 无血清培养基中的h(n个 = 4). (**c（c）**)在用5-HT（10 μM）24 小时(n个 = 5). (d日,**e（电子）**)在用载体（Con）或AhR配体3-甲基吲哚（3-MI，100）治疗之前，通过Amaxa电穿孔将EV或SERT转染Caco-2细胞 μM），色胺（TRYP，100 μM），或6-甲酰基吲哚[3,2b条]咔唑（FICZ，10 nM）24 h在无血清培养基中。(d日)描述*CYP1A1公司*EV转染时的表达(**e（电子）**)描述了*CYP1A1公司*SERT和EV转染细胞之间的诱导作用，除5-HT外的任何治疗均无差异(n个 = 3). (**（f）**)用载体（Con）或MAO抑制剂pargyline处理Caco-2细胞1 与5-HT联合治疗8小时前无血清培养基中的h(n个 = 3). 数据表示*CYP1A1公司*用qPCR定量mRNA。通过单向分析数据(一——**c（c）**,**（f）**)或双向(d日,**e（电子）**)方差分析后接Tukey’s(一——**c（c）**,**（f）**)或Bonferroni的(d日,**e（电子）**)多重比较测试**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, *****P（P）* < 0.0001 vs.未经治疗。^###*P（P）* < 0.001 vs.无氟西汀或EV.红色圆圈 = 未经处理的蓝色方形 = 5-HT，绿色三角形 = 3-MI，黄色三角形 = TRYP处理，黑钻石 = FICZ公司。

图3
5-HT对*CYP1A1公司*T84细胞中的mRNA。(一)在进行治疗之前，将T84细胞以低密度电镀，并在含有5%血清的培养基中分化10–14天。T84细胞治疗24小时带有5-HT（10）的h 微米–100 μM）在无血清培养基中。数据表示*CYP1A1公司*通过qPCR定量的信使核糖核酸(n个 = 4). (b条)将T84和Caco-2细胞以低密度电镀，并分别在含有5%或20%血清的培养基中分化10-14天。在T84和Caco-2细胞中测量SERT功能，即在Na存在或不存在的情况下摄取[H]5-HT⁺(n个 = 3). 数据通过单向分析(一)或双向(b条)方差分析，然后是Tukey的多重比较测试**P（P）* < 0.05, ***P（P）* < 0.01, *****P（P）* < 0.0001 vs.无5-HT或−Na⁺.^#*P（P）* < 0.05和^####*P（P）* < 组间0.0001。红色圆圈 = 未经处理的蓝色方形 = 5-HT，绿色圆圈=−纳⁺，橙色方形 = +纳⁺.

图4
5-HT诱导需要激活AhRCYP1A1公司mRNA。在未转染的情况下进行治疗之前，将Caco-2细胞以低密度电镀，并在含有20%血清的培养基中分化10-14天(一,d日,**e（电子）**). 当进行转染时，从24小时开始处理Caco-2细胞 h后转染(b条,**c（c）**). (一)用载体（Con）或AhR拮抗剂10处理Caco-2细胞 μM CH-223191（CH）和10 μM 3′，4′-二甲氧基黄酮（3′，4'-DMF）1 每个拮抗剂与5-HT（10）联合治疗前h μM）24 h在无血清培养基中。数据表示*CYP1A1公司*用qPCR定量mRNA。数据通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行分析(n个 = 4). (b条,**c（c）**)用对照siRNA（si-Con）转染Caco-2细胞，*阿赫勒*siRNA（si-AhR），或*ARNT公司*5-HT治疗前的siRNA（10 μM）适用于8 h（硅-*阿赫勒*)或24 h（硅-*ARNT公司*)在无血清培养基中。*阿赫勒*,*ARNT公司*、和*CYP1A1公司*用qPCR测定未处理细胞中mRNA的表达，结果表示为与对照siRNA相比的倍数变化t吨-测试。未配对双尾学生t吨-测试用于比较*CYP1A1公司*对照siRNA与5-HT处理后的mRNA诱导。*阿赫勒*或*ARNT公司*siRNA转染细胞(n个 = 3). (d日)用5-HT（10 μM）用于4 在无血清培养基中培养h后，分离细胞核和细胞质提取物，并对AhR进行Western blotting。细胞核AhR归一化为层粘连蛋白B1，细胞质AhR归一化为GAPDH。用配对双尾Student’st吨-测试(n个 = 4). 全长印迹如补充图S1所示。(**e（电子）**)用5-HT（10 μM）24 h在无血清培养基中。数据表示*阿赫勒*用qPCR定量mRNA(n个 = 3). **P（P） <* 0.05, ***P（P）* < 0.01, *****P（P）* < 0.0001与未治疗、对照siRNA或无5-HT的比较。^####*P（P）* < 0.0001与不使用AhR拮抗剂的5-HT治疗相比。不另说明。 = 不重要。红色圆圈 = 未经处理的蓝色方形 = 5-羟色胺。

图5
5-HT以依赖SERT的方式诱导XRE报告活性。从24小时开始处理Caco-2细胞转染后h。(一)Caco-2细胞与pGudLuc7.5荧光素酶XRE报告子或pGL3-basic以及β-gal哺乳动物表达质粒（CMV-β)脂质体。用5-HT（10 μM），AhR配体6-甲酰基吲哚[3,2b条]咔唑（FICZ）（10 nM）或车辆（Con）24 h在无血清培养基中。报告活性通过荧光素酶测定测定。使用四个重复的孔对每个治疗进行分析，并将数值标准化为β-gal活性。结果表示为未经处理（Con）pGL3-碱性转染细胞的折叠变化活性。通过单因素方差分析和Tukey多重比较检验分析数据(n个 = 3). **P（P）* < 0.05, *****P（P）* < 0.0001与转染pGudLuc7.5的未处理细胞的比较^##*P（P）* < 0.05 vs.pGL3-basic。(b条)Caco-2细胞与pGudLuc7.5荧光素酶XRE报告基因CMV瞬时共转染-β以及通过Amaxa电穿孔的SERT过表达载体或空载体（EV）。用5-HT（10 μM）24 h在无血清培养基中。报告活性通过荧光素酶测定测定。使用四个重复的孔对每个治疗进行分析，并将数值标准化为β-加仑。结果表示为未经处理的细胞活性的折叠变化。未配对双尾学生的数据分析t吨-测试(n个 = 4). **P（P）* < 0.05相对于EV。红圈 = 未经处理的蓝色方形 = 5-HT，黑钻石 = FICZ公司。

图6
SERT KO回肠粘膜的微阵列基因表达分析。按照方法所述，通过微阵列分析分析6 WT和6 SERT KO小鼠回肠粘膜中的基因表达。(一)热图显示WT和SERT KO之间选定差异表达基因的无监督分层聚类结果。(b条)以log2 | fold-change为截止标准显示差异表达基因分布的火山图| ≥ 0.585和p值 < 0.05. 红色显示上调基因，绿色显示下调基因。(**c（c）**)SERT KO小鼠回肠粘膜中显著上调或下调的选定基因列表。GEO上可获得的差异表达基因的完整列表（登录号GSE93534）。

图7
在SERT KO小鼠的肠道中，CYP1A1的表达受到抑制。(一)从WT和SERT KO小鼠的肠粘膜刮片中分离出总RNA。数据表示*CYP1A1公司*用qPCR定量mRNA。Mann-Whitney分析的数据单位测试(n个 = 5–6）***P（P）* < 0.01与重量(b条)从WT和SERT KO小鼠的肠粘膜刮片中制备蛋白裂解物。通过Western blot测定CYP1A1蛋白并将其归一化为GAPDH(n个 = 4–6). 全长印迹如补充图S2所示。(**c（c）**)从WT和SERT KO小鼠的回肠粘膜刮片中分离出总RNA。数据表示*阿赫勒*用qPCR定量mRNA。(d日)Western blot检测回肠粘膜中的AhR蛋白。用任意单位表示的相对带强度的密度分析。全长印迹如补充图S2所示。双尾未配对学生的数据分析t吨-测试(n个 = 4–6). ***P（P）* < 0.01, ****P（P）* < 0.001之间。未另行规定。 = 不重要。洋红色圆圈 = WT，绿松石三角形 = SERT KO公司。

图8
提出了血清素能和AhR信号通路之间的相互作用模型。在WT小鼠（左）的肠粘膜中，肠细胞表达SERT，该SERT能够通过Na转运5-HT到细胞中⁺氯⁻依赖过程。一旦进入细胞内，5-HT能够激活AhR以诱导核易位、与ARNT二聚并与AhR靶基因上的XRE结合。这将诱导靶基因的转录，如*Cyp1a1细胞*它将被转化为蛋白质。当SERT缺失时，如SERT KO小鼠（右），肠细胞无法有效地将5-HT转运到细胞中。这将导致AhR激活减少，随后AhR靶基因的表达减少，包括*Cyp1a1细胞*.

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血清素是通过AhR调节肠道CYP1A1的内源性调节因子

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