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.2018年8月；17（4）：e12765。
doi:10.1111/acel.12765。 Epub 2018年4月16日。

二甲双胍通过上调内质网谷胱甘肽过氧化物酶7缓解人类细胞衰老

精气坊 1 2, 杨继平 1 2, 吴勋 1 2, 张刚明 1 2, 陶莉 1 2, 喜娥王 1, Hong Zhang（张红） 1 2, Chih-Chen Wang先生 1 2, 刘广辉 1 2 3, 王磊（Lei Wang） 1 2
附属公司

二甲双胍通过上调内质网谷胱甘肽过氧化物酶7缓解人类细胞衰老

精气坊等。 老化细胞. 2018年8月.

摘要

二甲双胍是FDA批准的一种抗糖尿病药物，在动物模型中已被证明可以延长寿命。然而，二甲双胍对人类细胞的影响尚不清楚。在这里，我们发现低剂量二甲双胍治疗延长了人类二倍体成纤维细胞和间充质干细胞的寿命。我们报告低剂量二甲双胍上调内质网定位谷胱甘肽过氧化物酶7（GPx7）。衰老的人类细胞中GP×7表达水平降低，GPx7缺失导致细胞过早衰老。我们还表明，二甲双胍增加了核因子-红系2相关因子2（Nrf2）的核累积，该核因子与GPX7基因启动子中的抗氧化反应元件结合以诱导其表达。此外，二甲双胍-Nrf2-GPx7途径延缓了蠕虫的衰老。我们的研究为二甲双胍对人类细胞衰老的有益作用提供了机制性见解，并强调了Nrf2-GPx7通路在促衰老信号中的重要性。

关键词：老化；谷胱甘肽过氧化物酶7；二甲双胍；核因子-红细胞2相关因子2；氧化应激；衰老。

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数字

图1
图1
二甲双胍延缓人二倍体成纤维细胞复制性衰老(高密度纤维s） ●●●●。（a） 累计人口翻倍(持续专业发展)分析高密度纤维在没有（Ctrl）或存在100μ米二甲双胍（Met）。（b）左侧：衰老相关β-半乳糖苷酶(沙特阿拉伯‐β‐Gal）染色高密度纤维晚些时候的s(有限合伙人，第40页至第45页）。比例尺=100μm。赖特：百分比的统计分析沙特阿拉伯β‐Gal‐阳性细胞。（c）左侧:KI公司67在高密度纤维的有限合伙人.比例尺=20μm。赖特：百分比的统计分析KI公司67阳性细胞。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个生物复制品，n个每个条件>200个细胞*第页< .05, **第页< .01，通过双尾学生t吨测试
图2
图2
谷胱甘肽过氧化物酶7（GPx7）是人二倍体成纤维细胞衰老的关键调节因子(高密度纤维s） ●●●●。（a） 相对信使核糖核酸氧化还原相关基因水平高密度纤维200μ诱导s（P30）米二甲双胍（Met）6小时的分析RT公司–定量PCR，标准化为控制单元。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个技术复制品*第页< .05之间**对< .01，通过双尾学生t吨测试。结果代表了三个独立的实验。（b） 蛋白质表达急诊室局部氧化还原酶高密度纤维s（P30）未经或经200μ米二甲双胍24小时。（c）上部:普通合伙人x7英寸高密度纤维用指定浓度的二甲双胍处理s（P30）12小时。下部：表达式的统计分析普通合伙人x7.数据表示为平均值±扫描电镜来自四个生物复制品*第页< .05, **对< .01，通过双尾学生t吨测试。（d）普通合伙人x7英寸高密度纤维s（P36）未经或经100μ米二甲双胍自第25页起。（e） 的表达式急诊室‐局部过氧化物酶高密度纤维在两个早期通道都有s(欧洲药典)和有限合伙人（f）累计人口翻倍(持续专业发展)分析高密度纤维慢病毒sh转导的s增殖核糖核酸控件（shCtrl）和sh核糖核酸瞄准GPX公司7（第页GPX公司7).插入:普通合伙人中的x7表达式高密度纤维用慢病毒转导。（g）持续专业发展shCtrl或sh的分析GPX公司7 高密度纤维如果没有（Ctrl）或存在100μ米二甲双胍。数据表示为平均值±扫描电镜从三个生物重复中**对< .01，不另作说明，不重要，通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试。（h）左侧:KI公司67表达于高密度纤维s来自第37页的（g）。比例尺=20μm。赖特：百分比的统计分析KI公司67阳性细胞。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个生物复制品，n个每个条件>200个细胞*第页< .05, **第页< .01，未另行规定，不重要，通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试。内质网
图3
图3
二甲双胍上调谷胱甘肽过氧化物酶7(普通合伙人x7）通过激活核因子-红细胞2相关因子2（Nrf2）。（a）左侧人二倍体成纤维细胞Nrf2转位的免疫荧光分析(高密度纤维s） 处理或不处理100μ米二甲双胍（Met）4小时。比例尺=10μm。细胞核轮廓为白色圆点。赖特：定位于细胞核的Nrf2荧光强度的统计分析。数据表示为平均值±扫描电镜,n个=每种情况7个核**第页< .01，通过双尾学生t吨测试。结果代表了两个独立的实验。（b） 细胞质的普通合伙人x7和核Nrf2英寸高密度纤维用指定浓度的二甲双胍处理6小时。α‐Tubulin和Lamin B1分别用作细胞质和核负荷对照。（c）左侧:普通合伙人中的x7表达式高密度纤维用shCtrl或sh转导的自然资源基金2慢病毒，经或不经100μ米二甲双胍12小时；正确的：效率自然资源基金2消耗。（d）左侧:普通合伙人x7蛋白质水平高密度纤维s转换为GFP公司（Ctrl），野生型自然资源基金2(重量)，或构成性激活自然资源基金2(加利福尼亚州)慢病毒；赖特:普通合伙人x7蛋白质水平高密度纤维在不使用或使用200μ的情况下刺激s米 tBHQ公司持续12小时。（e） 萤光素酶报告基因测定法GPX公司7启动子活性。HEK公司用荧光素酶报告体转染293T细胞(pGL公司3‐碱性）含有抗氧化反应元件（ARE）你好‐1或一系列5′片段（F1–F6）GPX公司7启动子如所示，与任一pc组合DNA3.1‐自然资源基金2或空向量(电动汽车). 相对荧光素酶活性相对于电动汽车转染。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个技术复制品**第页< .01通过双尾学生t吨测试。结果代表了三个独立的实验。（f） 中国IP（IP）‐定量PCRNrf2入住率分析GPX公司7发起人。上部：本地化是包含位点（S1）和一个非特异性位点（S2）GPX公司7发起人。下部：频道IP（IP）‐定量PCR使用IgG或抗-Nrf2抗体进行分析高密度纤维s，带或不带100μ米二甲双胍治疗36小时。富集值标准化为输入值，并显示为相对于IgG组的折叠变化。数据表示为平均值±扫描电镜来自六个技术复制品**第页< .01，不另作说明，不重要，通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试。（g） Nrf2和Nrf2结合的电泳迁移率变化分析（EMSA）GPX公司7‐是.5〃-生物素标记GPX公司7‐是从S1培养高密度纤维s核提取物(氖)如果没有或存在五倍或50倍的未标记你好‐1‐是或突变你好‐1‐是(你好‐1‐母马). 开放箭头表示内源性Nrf2与GPX公司7‐是，填充箭头表示Nrf2的三元络合物，GPX公司7‐是和抗-Nrf2抗体。
图4
图4
谷胱甘肽过氧化物酶7(普通合伙人x7）在防御人二倍体成纤维细胞氧化应激中起关键作用(高密度纤维s） ●●●●。（a，b）细胞增殖活性分析高密度纤维在P35（a）或P36（b）处，不存在或存在1m米百草枯(性能确认)持续24小时。这个高密度纤维s用shCtrl稳定转染,第页GPX公司7,GFP公司,GPX公司7慢病毒，如图所示。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个技术复制品**第页< .01通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试。结果代表了两个独立的实验。（c） Western blotting检测核因子-红细胞样2相关因子2（Nrf2）的敲除效率和普通合伙人x7由慢病毒引起，如高密度纤维第（d，e）条左侧:沙特阿拉伯‐β-Gal染色（d）和KI公司67表达（e）高密度纤维第28页，秒。比例尺分别为（d）和（e）中的50和20μm。赖特：百分比的统计分析沙特阿拉伯β‐Gal‐阳性细胞和KI公司67阳性细胞如图所示。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个生物复制品，n个每个条件>200个细胞**第页< .01通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试
图5
图5
二甲双胍‐Nrf2‐普通合伙人人骨髓间充质干细胞的x7通路功能(HMSC公司s） ●●●●。（a） 人二倍体成纤维细胞核因子-红细胞2相关因子2（Nrf2）和谷胱甘肽过氧化物酶7（GP×7）的蛋白表达(高密度纤维s） 以及HMSC公司s在欧洲药典和有限合伙人，以及警告 +/+和警告 −/− HMSC公司第5页为s。对于HMSC公司s、 P3–P5取为欧洲药典和P9–P12 as有限合伙人（b）Nrf2和普通合伙人野生型x7HMSC公司秒(自然资源基金2 +/+)和HMSC公司s在遗传上具有内源性自然资源基金2（A254G）变化(自然资源基金2 AG公司 / AG公司). （c，f）累计人口翻倍(持续专业发展)分析HMSC公司的扩散。野生型HMSC公司从P3到P12的s在不存在或存在100μ米二甲双胍（Met）（c）。插入：的表达式普通合伙人第7页x7。HMSC公司s用shCtrl和sh转换GPX公司7慢病毒从P4持续培养至P9（f）。插入:普通合伙人中的x7表达式HMSC公司用慢病毒转导。（d，g）左侧:沙特阿拉伯野生型β‐Gal染色HMSC公司s在有限合伙人（d） 和慢病毒转导的HSMC公司分别在P7（g）时为s。比例尺=100μm。赖特：百分比的统计分析沙特阿拉伯β‐Gal‐阳性细胞。（e，h）左侧:KI公司67野生型表达HMSC公司的有限合伙人（e） 和慢病毒转导HMSC公司分别在P7（h）时为s。比例尺=20μm。赖特：对KI公司67阳性细胞。数据表示为平均值±扫描电镜来自三个生物复制品，n个每个条件>200个细胞*第页< .05, **第页< .01，通过双尾学生t吨测试。（i，j）移植后体内滞留量的测量HMSC公司体内成像系统。左侧：有条件HMSC公司连续服用二甲双胍或用sh转导核糖核酸将过表达荧光素酶的慢病毒（j）植入左右两侧胫骨前免疫缺陷小鼠的肌肉。在植入后的第五天或第六天捕获光子通量。赖特：每只小鼠植入HMSC公司s，相对发光强度归一化为对数2折叠。数据显示为散点图，显示平均值±扫描电镜，来自十一（i）个或四（j）个生物复制*对< .05, **第页< .01，通过双尾学生t吨测试。
图6
图6
二甲双胍SKN公司‐1‐GPX公司‐6通路功能秀丽隐杆线虫.（a）左：mcherry翻译融合到客户尽职调查编码通用条款‐6和绿色荧光粉翻译融合到基因组DNA编码有轨电车-1或线粒体信号肽（mito）。该表达式由y37a1b.5年发起人。赖特：转基因蠕虫同时表达GPX公司‐6 [Py37a1b.5：：gpx‐6：：mcherry]（红色通道）和TRAM公司‐1（上部）[Py37a1b.5:：电车‐1:：gfp]（绿色通道）或Mito‐GFP公司（下部）[Py37a1b.5:：mito:：gfp]. 比例尺=5μm。（b） 人谷胱甘肽过氧化物酶7（GPx7）和秀丽线虫 GPX公司‐6过氧化物酶活性通过340 nm处吸光度的降低来测量，因为纳德ph消费。插入：重组人的纯化交车前检查，人类普通合伙人x7，和秀丽线虫 GPX公司‐6.（c）上部：gfp翻译融合到全长基因组DNA属于通用条款‐6包括2876bp启动子区域。下部：蠕虫表达的图像和量化GPX公司‐6::GFP公司受车辆控制（Ctrl）或50 m米二甲双胍（Met）用于L4幼虫期后24小时。比例尺=100μm。数据表示为平均值±扫描电镜,n个每种情况≥14个蠕虫**第页< .01，通过单向方差分析，Tukey的多重比较测试。（d） 蠕虫表达GPX公司‐6::GFP公司没有或有skn‐1号机组 核糖核酸我经受了50米的考验米二甲双胍用于L4幼虫期后48小时，成像并定量。比例尺=100μm。数据表示为平均值±扫描电镜,n个每种情况下>15条蠕虫**第页< .01通过双向方差分析，Tukey的多重比较测试。结果代表了两个独立的实验。（e） 生存曲线重量或通用条款‐6 核糖核酸i蠕虫未经或经50 m处理米二甲双胍。结果代表了四个独立实验。饲养在0米和50米的媒介喂养蠕虫的平均寿命分别为16.1和18.7天米二甲双胍，两组的生存曲线有显著差异(第页= 0.0012（通过对数秩检验）。平均寿命为13.8天和14.6天通用条款‐6 核糖核酸我喂了0米和50米长的虫子米二甲双胍，两组的生存曲线均不显著(第页= .2455（通过对数秩检验）（另见表S1）。
图7
图7
二甲双胍通过Nrf2延缓衰老的模型普通合伙人x7通路。核因子类红细胞2相关因子2（Nrf2）是调节细胞抗氧化反应的主转录因子。通过与抗氧化反应元件的结合(是)，Nrf2刺激多种抗氧化酶的表达，其中谷胱甘肽过氧化物酶7（GPx7）是一种独特的急诊室局部过氧化物酶。在年轻细胞中，充足的Nrf2转录诱导普通合伙人x7表达以防御氧化应激。在旧细胞中，Nrf2和普通合伙人x7表达减少，氧化应激累积。小剂量二甲双胍可促进Nrf2的核转位，上调普通合伙人x7缓解细胞老化。内质网
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