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.2018年4月13日;9(1):1466.
doi:10.1038/s41467-018-03731-w。

利用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统编辑体细胞基因组以实现精确肿瘤建模

附属公司

利用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统编辑体细胞基因组以实现精确肿瘤建模

芭芭拉·奥尔德里尼等。 国家通讯社. .

摘要

为了准确地概括人类疾病的异质性,动物模型需要重建多种复杂的基因改变。在这里,我们将RCAS-TVA系统与CRISPR-Cas9基因组编辑工具相结合,以精确建模人类肿瘤。我们发现,多种已知肿瘤抑制基因(Trp53、Cdkn2a和Pten)在神经干细胞中的体细胞缺失导致高级胶质瘤形成。此外,通过同时传递成对的导向RNA,我们通过染色体缺失(Bcan-Ntrk1)或染色体易位(Myb-Qk)产生具有致癌潜力的不同基因融合。最后,使用同源直接重配对,我们还产生了携带人类BRAF V600E同源突变的肿瘤,这些肿瘤经常在多种肿瘤中被识别,包括不同类型的胶质瘤。总之,我们已经开发了一种用于体内体细胞基因组编辑的功能极其广泛的小鼠模型,这将产生更准确的癌症模型,特别适合于临床前测试。

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数字

图1
图1
TVA/Cas9小鼠品系大脑中Cas9的表达。,b条四周龄儿童脑切片的免疫荧光染色Ntv-a;Nes-Cre;LSL-Cas9型Gtv-a;hGFAP-核心;LSL-Cas9型抗EGFP(Cas9)、NESTIN和GFAP抗体的小鼠。CAS9在整个大脑中广泛表达,并与NESTIN和GFAP共同定位于室下区。左面板:全脑切片;右侧面板:左侧面板插图的放大倍数更高。比例尺:左侧面板,500微米;右侧面板,100μm。LV侧脑室
图2
图2
RCAS-gRNA质粒敲除肿瘤抑制基因可诱导高级别胶质瘤。RCAS-gRNA质粒示意图。b条RCAS-gRNA的体外验证Trp53基因,Pten、Cdkn2a和非目标控件(Ctrl)。使用所示抗体对NIH-3T3 TVA-Cas9成纤维细胞和Ntv-a;LSL-Cas9型用pMSCVhygro-CRE(NSC TVA-Cas9)转导的神经干细胞(NSC)。为了诱导p53表达,收集24个细胞电离辐射暴露后h(10Gy)。c(c)表总结了在Ntv-a;Nes-Cre;LSL-Cas9型Gtv-a;hGFAP-核心;LSL-Cas9型幼鼠和成年小鼠。联合注射针对不同抑癌基因的RCAS-PDGFB和RCAS-gRNA可加速肿瘤形成,增加肿瘤外显率和高级别胶质瘤的发生率。使用所示抗体对代表性RCAS-PDGFB/gRNA肿瘤进行苏木精-伊红染色(H&E)和免疫组织化学染色(IHCs)。注意PTEN在正常血管系统中的表达,但在RCAS-PDGFB的肿瘤细胞中没有表达 + RCAS-Pten-gRNA肿瘤。插图显示放大率较高的图像。比例尺:H&E 100微米;国际卫生标准50微米。e(电子)使用所示抗体对肿瘤球的全细胞提取物进行Western blot分析。(f)所示肿瘤上p53(左面板)和p21(右面板)的IHC 1暴露10小时后Gy-IR。比例尺:50微米。使用所示抗体对肿瘤球全细胞提取物进行Western blot分析24暴露10小时后Gy红外。小时肿瘤球3 mRNA的实时定量PCR(qPCR)分析暴露10小时后Gy IR数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3); A.U.任意单位
图3
图3
在TVA-Cas9成年小鼠中普遍存在的Cas9表达不会诱导强烈的免疫反应。左侧面板:流式细胞术分析Ntv-a;LSL-Cas9型;hUBC中心2所示基因型的小鼠。连续5周在食物中使用三苯氧胺治疗4周龄小鼠。右侧面板:代表性流式细胞仪图,分析中使用了门控策略。学生的t吨测试:***P(P)<0.001, **P(P)<0.005*P(P)<0.05. 上下铰链对应于第一和第三个四分位(第25和75百分位)。上部晶须从铰链延伸至1.5范围内的最高值×铰链的IQR,其中IQR是四分位范围。下部晶须从铰链延伸至1.5范围内的最低值×铰链的IQR。b条左侧面板:流式细胞术分析小鼠大脑中的淋巴细胞、巨噬细胞和小胶质细胞右面板:代表性流式细胞仪图,以及用于分析的门控策略。c(c)表总结了在Ntv-a;LSL-Cas9型;hUBC-CreERT2型成年小鼠。注射RCAS-PDGFB的小鼠 + RCAS-Trp53-gRNA和三苯氧胺诱导Cas9表达,发展为高级胶质瘤。RCAS-PDGFB的H&E和Cas9 IHC + 用于指定治疗的RCAS-Trp53-gRNA肿瘤。高级别胶质瘤特征和Cas9表达仅在三苯氧胺治疗的小鼠中存在。比例尺:H&E 100微米;国际卫生标准50微米
图4
图4
Bcan-Ntrk1号机组基因融合促进高级别胶质瘤的形成。的示意图Bcan公司Ntrk1号机组基因座和Bcan-Ntrk1号机组基因融合。指示的是靶向基因的gRNA和用于指示基因组区域的PCR扩增的引物。b条顶部面板:表达Bcan和Ntrk1 gRNAs的RCAS-gRNA-pair载体。底部面板:使用从p53-空用所示gRNAs转导的TVA-Cas9神经干细胞。亚克隆了Bcan-Ntrk1gRNA感染细胞的PCR带,并通过Sanger测序进行了分析。显示了四个独立克隆的序列和一个代表性色谱图。c(c)左图:荧光原位杂交(FISH)探针设计图。BAC克隆BMQ-437D10(红色)位于缺失区域,BMQ-386N22(绿色)用于控制3号染色体。鼠标BAC用绿色和红色条表示。右面板:使用双色探针检测Ntrk1-Bcan基因间微缺失的典型FISH结果。对照绿色信号用于计算3号染色体的数量。红色信号的丢失表明微缺失。比例尺:5微米。顶部面板:的示意图Bcan-Ntrk1号机组融合转录本。底部面板:(左)对来自p53-空使用Bcan-Fw和Ntrk1-Rev引物,用指示的gRNAs转导TVA-Cas9神经干细胞;(中)亚克隆了PCR条带,显示了两个独立克隆的序列和一个代表性的色谱图;(右)qPCR,使用Ntrk1_3′-Fw和Ntrk2_3′-Rev引物,显示Ntrk1 mRNA在表达Bcan-Ntrk1号机组融合。数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3); A.U.任意单位。e(电子)H&E和IHC使用所指示的抗体。白色箭头指向有丝分裂图。比例尺:H&E 100微米;国际卫生标准50微米。(f)RCAS-Bcan-Ntrk1-gRNA对诱导胶质瘤的Kaplan-Meier生存曲线Gtv-a;hGFAP-核心;LSL-Cas9;第53页液氧/液氧注射小鼠。Tva公司或Cre对照组室友被用作注射对照。原木库P(P)价值 = 0.0008.对从Bcan-Ntrk1肿瘤组织中提取的基因组DNA进行的PCR(泳道2-4)证实了Bcan-Ntrk1号机组基因融合。来自NSC的基因组DNA被用作阴性对照(通道1)
图5
图5
Bcan-Ntrk1诱导的胶质瘤对TRK抑制剂entrectinib产生耐药性。p53-空TVA-Cas9 NSC、Bcan-Ntrk1或PDGFB肿瘤球暴露96h增加恩曲替尼(pan-TRK抑制剂)的剂量。b条根据Annexin V阳性细胞48的测定,Entrectinib在Bcan-Ntrk1肿瘤球中的治疗可诱导凋亡增加治疗后h。来自两个典型实验的数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3); 学生的t吨测试:***P(P)<0.001; A.U.任意单位。c(c)使用Bcan-Ntrk1或PDGFB肿瘤球上的特定抗体进行Western blot分析,这些肿瘤球在没有生长因子的情况下生长过夜,然后用恩曲替尼处理(1μM)用于16小时。恩曲替尼耐药细胞系的生成示意图(详见正文)。e(电子)对暴露96小时的亲代Bcan-Ntrk1、R1和R2肿瘤球进行细胞增殖试验h增加恩曲替尼的剂量。(f)根据Annexin V阳性细胞的测定,在恩曲替尼耐药细胞中缺乏凋亡诱导,72恩曲替尼治疗后h(100nM)。来自两个典型实验的数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3); 学生的t吨测试:**P(P)<0.005, *P(P)<0.05; A.U.任意单位。使用经恩曲替尼治疗的双亲Bcan-Ntrk1、R1和R2肿瘤球上的特定抗体进行Western blot分析(1μM)。小时对暴露96小时的亲代Bcan-Ntrk1、R1和R2肿瘤球进行细胞增殖试验h增加曲美替尼的剂量
图6
图6
生成Myb-Qk公司染色体易位。的示意图Myb公司Qk(质量)基因座和Myb-Qk公司基因融合。所示为针对两个基因的gRNA和用于PCR扩增所示基因组区域的引物。b条顶部面板:表达Myb和Qk gRNAs的RCAS-gRNA-pair载体。底部面板:使用从p53-空用所示gRNAs转导的TVA-Cas9神经干细胞。对Myb-Qk-gRNA感染细胞的PCR带进行亚克隆,并通过Sanger测序进行分析。显示了三个独立克隆的序列和一个代表性色谱图。c(c)顶部面板:的示意图Myb-Qk公司融合转录本。底部面板:(左)对来自p53-空使用Myb-Fw和Qk-Rev引物,用指示的gRNAs转导TVA-Cas9神经干细胞;(右)亚克隆了PCR带,显示了两个独立克隆的序列和一个代表性色谱图。顶部面板:FISH探头设计图(详见方法)。鼠标BAC用绿色和红色条表示。底部面板:使用设计用于检测Myb-Qk易位的断裂部分探针的典型FISH结果。比例尺:5微米。e(电子)不同基因表达的火山图Myb-Qk公司(n个 = 2) 与Ctrl-gRNA细胞相比(n个 = 2).(f)使用公布的MYB-QK特征基因进行GSEA分析。NES归一化富集分数、FDR假发现率。qPCR分析显示Myb QK公司-激活的基因p53-空TVA-Cas9 NSC表达Myb-Qk公司融合。数据表示为平均值±标准偏差(n个 = 3); 学生的t吨测试:***P(P)<0.001, **P(P)<0.005, *P(P)<0.05; A.U.任意单位。小时 p53-空用Myb和Qk gRNA而非Ctrl gRNA转导的TVA-Cas9神经干细胞能够在软琼脂中生长
图7
图7
胶质瘤的形成布拉夫V637E型.携带Braf gRNA和Braf的质粒示意图V637E型同源定向修复(HDR)供体。b条H&E和IHC使用所示抗体。白色箭头指向有丝分裂图。比例尺:H&E 100微米;国际卫生标准50微米。c(c)在两个BRAF上使用抗BRAF V600E抗体的IHCV637E型突变肿瘤。对侧正常脑作为阴性对照。对进行细胞增殖分析p53-空TVA-Cas9 NSC和布拉夫V637E版本肿瘤球暴露96h增加达布雷尼的剂量。e(电子)使用特定抗体进行Western blot分析p53-空TVA-Cas9 NSC和布拉夫V637E型肿瘤球在没有生长因子的情况下生长过夜,然后用达布雷尼(200nM)。(f)左面板:达布雷尼b耐药细胞系(dab-R)的生成示意图。右侧面板:对父母进行细胞增殖试验布拉夫V637E型和dab-R肿瘤球暴露96h增加达布雷尼的剂量。使用父母的特定抗体进行Western blot分析布拉夫V637E型和dab-R肿瘤球在没有生长因子的情况下生长过夜,然后用达布雷尼(200nM)。小时对亲代进行细胞增殖测定布拉夫V637E型和dab-R肿瘤球暴露96h增加曲美替尼的剂量

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引用人

工具书类

    1. Vogelstein B等人,《癌症基因组景观》。科学。2013;339:1546–1558. doi:10.1126/science.1235122。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Lawrence MS等人,21种肿瘤类型癌症基因的发现和饱和分析。自然。2014;505:495–501. doi:10.1038/nature12912。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 牟H,Kennedy Z,Anderson DG,Yin H,Xue W.通过CRISPR-Cas9基因组编辑精确建立癌症小鼠模型。《基因组医学》2015;7:53. doi:10.1186/s13073-015-0178-7。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Platt RJ等。用于基因组编辑和癌症建模的CRISPR-Cas9敲除小鼠。单元格。2014;159:440–455. doi:10.1016/j.cell.2014.09.014。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Sánchez-Rivera FJ等人。通过体细胞基因组编辑快速建模癌症中的协同遗传事件。自然。2014;516:428–431. doi:10.1038/nature13906。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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