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.2018年6月1日；293(22):8614-8625.
doi:10.1074/jbc。M117.809822。 Epub 2018年4月13日。

Sirtuin-1（SIRT1）通过减弱未折叠蛋白反应中的PERK-eIF-2α-CHOP途径刺激生长板软骨生成

康晓敏 1, 魏阳 1, 王瑞琪（Ruiqi Wang） 1, 谢天平 1, 李惠霞 2, 冯东旭 1 三, 金鑫鑫 1, 孙洪志 4, 吴淑芳 5
附属公司

Sirtuin-1（SIRT1）通过减弱未折叠蛋白反应中的PERK-eIF-2α-CHOP途径刺激生长板软骨生成

康晓敏等。 生物化学杂志. .

摘要

全国广告部+-依赖性去乙酰化酶sirtuin-1（SIRT1）已成为软骨生成和软骨稳态的重要调节因子，这些过程对生理骨骼生长很重要，在骨关节炎中失调。然而，SIRT1调节软骨生成的功能作用和潜在机制尚不清楚。利用培养的大鼠跖骨和从大鼠跖骨雏形分离的软骨细胞，我们研究了SIRT1抑制剂EX527或SIRT1 siRNA对软骨细胞增殖、肥大和凋亡的影响。我们发现EX527或SIRT1 siRNA抑制软骨细胞增殖和肥大并诱导凋亡。我们还观察到SIRT1抑制主要诱导生长板软骨细胞内质网（ER）应激反应的PERK-eIF-2α-CHOP轴。值得注意的是，EX527或SIRT1 siRNA介导的跖骨生长和生长板软骨生成抑制被苯丁酸部分中和，苯丁酸是一种减轻内质网应激的化学伴侣。此外，EX527介导软骨细胞功能受损(即软骨细胞增殖、肥大和凋亡）在CHOP中部分逆转-/-细胞。我们还提供了SIRT1与PERK发生物理相互作用并脱乙酰化PERK的证据。总之，我们的研究结果表明，SIRT1脱乙酰化了PERK并减弱了未折叠蛋白反应途径的PERK-eIF-2α-CHOP轴，从而促进生长板软骨形成和纵向骨生长。

关键词：PERK公司；骨生长；软骨细胞；软骨生成；内质网应激；生长板；sirtuin 1（SIRT1）；未折叠蛋白反应（UPR）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突

数字

图1。
图1。
EX527和PBA对跖骨纵向生长的影响。 一和b条，胎鼠跖骨（怀孕后20天）在含有分级浓度EX527（0–100μ米,n个=20–24/组）。在实验开始和结束时，使用解剖显微镜中的目镜测微计测量骨长度。培养3天后，从跖骨中获取蛋白质和总RNA，并按照“实验程序”进行处理c（c）SIRT1和ER应激标记的表达，包括PERK磷酸化(p-PERK公司)，eIF-2α磷酸化(p-eIF-2型α） Western blotting检测CHOP。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。d日实时PCR检测SIRT1、ATF4和CHOP的相对表达，结果显示为所有组的基因表达水平均与对照组一致。e（电子）生长板软骨细胞的透射电镜显示，对照跖骨的粗面内质网结构正常，而EX527处理的跖骨内质网池异常扩张。这个箭头指示ER插入显示选定区域的高倍率。比例尺，1微米。（f）胎鼠跖骨（怀孕后20天）在含有EX527（30μ米,n个=20/组）和/或PBA（2米米,n个=20/组）。Western blotting检测p-PERK、p-eIF-2α和CHOP的表达。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。克实时PCR检测ATF4和CHOP的相对表达。结果显示为所有对照组的基因表达水平。小时和我在实验开始和结束时，使用解剖显微镜中的目镜测微计测量骨骼长度。数据表示为各散点图中的平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图2。
图2。
EX527和PBA对跖骨生长板软骨细胞增殖、肥大和凋亡的影响。在实验期结束时，将跖骨固定并嵌入石蜡，获得5至7μm厚的纵切面。一甲苯胺蓝染色的跖骨，每次处理均获得代表性图像。插图显示选定区域的高倍率。比例尺，100微米。PZ公司增殖区；HZ（赫兹），肥厚区。b条用免疫组织化学方法检测培养的跖骨中Col10a1的表达。比例尺，50微米。c（c），分别定量分析生长板的骺区、增殖区和肥大区的高度(n个=6/组）。在培养3天后，将BrdU添加到培养基中，并将骨胚再孵育2小时。d日，BrdU阳性细胞的代表性图像。BrdU阳性细胞染色棕色的（由箭头).比例尺，100微米。分别分析骨骺区和增殖区BrdU阳性细胞的数量(n个=6/组）。e（电子）实时PCR检测跖骨生长板软骨细胞中Col10a1的相对表达。结果显示为所有对照组的基因表达水平。（f），TUNEL阳性细胞的代表性图像。TUNEL阳性细胞被染成红色荧光（由箭头). 量化显示在正确的.数据在每个散点图中表示为平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图3。
图3。
EX527对培养的原代软骨细胞增殖、肥大和凋亡的影响。软骨细胞在加入或不加入EX527（30μ米). 对于拯救实验，用EX527预处理软骨细胞48小时，然后用空载体（对照质粒）或含有SIRT1的质粒（SIRT1质粒）再转染48小时。通过蛋白质印迹分析蛋白质表达和mRNA表达(一)和实时PCR(b条)分别是。c（c），原代软骨细胞用BrdU标记，并按照“实验程序”进行染色。典型的BrdU阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。d日Western blotting检测软骨细胞中cyclin D1和PCNA的表达。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。e（电子），用TUNEL标记原代软骨细胞。代表性TUNEL阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。（f）Western blotting检测Bcl-2和Bax的表达。每种蛋白质都有三个独立实验的代表性印迹。克，软骨细胞与ITS培养7天，并在30μ米EX527，结合或不结合10μ米白藜芦醇。在培养期结束时，收获软骨细胞，裂解，电泳，并对SIRT1、Col10a1和MMP13进行免疫印迹，对每种蛋白质进行来自三个独立实验的代表性印迹。数据在每个散点图中表示为平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图4。
图4。
SIRT1 siRNA和PBA对培养的原代软骨细胞增殖、肥大和凋亡的影响。转染对照siRNA或SIRT1 siRNA的软骨细胞在无或存在2 m的情况下培养米PBA公司。一在培养期结束时，通过Western blotting检测SIRT1、p-PERK、p-eIF-2α和CHOP蛋白的表达。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。b条实时PCR检测ATF4和CHOP mRNA的表达。结果显示为所有对照组的基因表达水平。c（c），软骨细胞用BrdU标记并准备染色。代表性的BrdU阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。d日Western blotting检测cyclin D1和PCNA的表达。针对每种蛋白质，提供了来自三个独立实验的代表性印迹。e（电子），软骨细胞用TUNEL标记。代表性TUNEL阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。（f）通过Western blotting测定Bcl-2和Bax蛋白水平。每种蛋白质都有三个独立实验的代表性印迹。克，软骨细胞用ITS处理7天，在30μ米EX527，结合或不结合2m米PBA公司。在培养期结束时，采集软骨细胞，进行裂解、电泳，并对Col10a1和MMP13进行免疫印迹。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。数据在每个散点图中表示为平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图5。
图5。
CHOP siRNA部分逆转EX527介导的软骨细胞增殖和肥大抑制，并中和EX527中介导的促凋亡作用。软骨细胞转染CHOP siRNA 72 h或培养30μ米EX527与对照或CHOP siRNA结合。一，通过蛋白质印迹检测CHOP的表达。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。b条，软骨细胞用BrdU标记并准备染色。代表性BrdU阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。c（c）Western blotting检测cyclin D1和PCNA蛋白表达。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。d日，软骨细胞用TUNEL标记。代表性TUNEL阳性细胞由箭头所示。比例尺，100微米。量化显示在正确的。e（电子）Western blotting检测Bcl-2和Bax的表达。每种蛋白质都有三个独立实验的代表性印迹。（f）实时PCR检测C/EBP-β和Runx2的相对表达。结果显示为所有对照组的基因表达水平。克用ITS处理软骨细胞7天，在没有或有EX527的情况下培养，并转染CHOP siRNA。在培养期结束时，采集软骨细胞，进行裂解、电泳，并对Col10a1和MMP13进行免疫印迹。每种蛋白质都有四个独立实验的代表性印迹。数据在每个散点图中表示为平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.
图6。
图6。
SIRT1与PERK发生物理相互作用并使其脱乙酰。 一软骨细胞裂解物中乙酰化蛋白的免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹。输入，免疫沉淀前上清液；IP（IP）免疫沉淀；免疫球蛋白G，阴性对照。b条从软骨细胞裂解物中免疫沉淀PERK，并用抗乙酰赖氨酸抗体免疫印迹分析其乙酰化水平。c（c）和d日，PERK是从用EX527（30μ米)或SIRT1 siRNA，用抗乙酰赖氨酸抗体免疫印迹法测定其乙酰化水平。使用ImageJ软件分析乙酰化PERK的相对数量，如所示d.电子，内源性SIRT1和PERK之间的物理相互作用通过免疫共沉淀证实。用抗SIRT1抗体从软骨细胞裂解液中沉淀SIRT1，并用抗PERK抗体进行印迹，反之亦然。（f）和克，PERK从对照或用THG处理的软骨细胞中免疫沉淀（80n米)或EX527（30μ米)或SIRT1 siRNA，并分析其乙酰化和磷酸化水平。使用ImageJ软件分析乙酰化和磷酸化PERK的相对量，如克每个蛋白质都有三到四个独立实验的代表性印迹。数据在每个散点图中表示为平均值±S.D.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.01.小时，提出了软骨细胞SIRT1保护功能模型。SIRT1保护软骨细胞免受内质网负荷诱导的损伤，并在软骨形成过程中维持内质网的稳态。
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