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.2018年4月12日；9(1):1418.
doi:10.1038/s41467-018-03817-5。

GFI1通过调节MRE11和53BP1的PRMT1依赖甲基化促进有效的DNA修复

查尔斯·瓦德奈斯 1, 陈日燕 1, 詹妮弗·弗拉斯扎克 1, 俞振宝 2, 乔纳森·布莱斯 1, 乔丹·平德 3, 达丽亚·弗兰克 4, 塞勒斯·坎丹普尔 4, 何塞·赫伯特 5 6 7, 格雷厄姆·德莱尔 3, Jean-François科特迪瓦 1 8, 斯特芬妮·理查德 2 9 10 11, 亚历山大·奥尔特温 2 10 11 12, 埃利奥特·德罗贝茨基 8, 塔里克·莫雷 13 14 15
附属公司

GFI1通过调节MRE11和53BP1的PRMT1依赖甲基化促进有效的DNA修复

查尔斯·瓦德奈斯等。 国家公社. .

摘要

GFI1是一种在淋巴细胞中表达的转录调节因子，是T淋巴细胞白血病发生和维持所必需的“肿瘤”因子。GFI1缺失导致电离辐射超敏反应，其分子机制尚不清楚。在这里，我们证明GFI1是T细胞中调节关键DNA损伤信号和修复蛋白所必需的。具体而言，GFI1与精氨酸甲基转移酶PRMT1及其底物MRE11和53BP1相互作用。我们证明GFI1能使PRMT1结合MRE11和53BP1并使其甲基化，这是它们在DNA损伤反应中发挥作用所必需的。因此，我们的结果证明GFI1可以发挥非转录作用，介导参与DNA修复的蛋白质的翻译后修饰。这些发现对过度表达GFI1的肿瘤的治疗反应有直接影响，并提示GFI1活性可能是这些恶性肿瘤的治疗靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
GFI1促进DNA损伤的存活和修复。一将GFI1过度表达的SupT1细胞和载体控制细胞接种在每毫升100万个细胞中，并暴露于2.5（左面板）或5（右面板）Gy IR。第二天对细胞进行计数。虚线表示平均细胞数，并显示了三次重复实验的单个数据点*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 韦尔奇校正后的0.001吨-测试。b条将A中的SupT1细胞暴露于10（左图）或50（右图）nM阿糖胞苷。对细胞进行计数，结果如下所示一.c（c） Gfi1公司KO Jurkat T细胞和亲代对照细胞以每毫升100万个细胞接种，并暴露于2.5 Gy IR。对细胞进行计数，结果如下所示一.d日Jurkat细胞，如c（c）暴露于10 nM阿糖胞苷。对细胞进行计数，结果如下所示一.e（电子）将GFI1过表达的SupT1细胞和载体对照暴露于5 Gy，并允许在指定的时间内恢复。然后用碱性彗星试验对细胞进行裂解和分析。彗星尾部力矩平均值显示在右侧，有代表性的图像。显示了三个重复实验中的一个。误差条表示s.d。（f）胸腺细胞提取自Gfi1公司体重、年龄和性别匹配Gfi1公司KO小鼠按照e（电子）图中显示了具有代表性的图像。克胸腺细胞来自Gfi1型KI、KD和KO小鼠按照e（电子）.小时将含有GFI1 KO的Jurkat细胞和亲代对照细胞作为e（电子）
图2
图2
GFI1影响IR后γ-H2AX信号传导和HR。一胸腺细胞提取自Gfi1公司体重、年龄和性别匹配Gfi1公司KO小鼠暴露于5 Gy IR并允许在指定的时间内恢复。用胞浆将细胞铺在玻片上，固定并染色γ-H2AX。γ-H2AX病灶的平均数量如右图所示。显示了三个重复实验中的一个。误差线代表s.d*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 韦尔奇校正后的0.001吨-测试。比例尺代表10 微米。b条GFI1过表达的SupT1细胞和载体对照被视为一.c（c）胸腺细胞提取方法一γ-H2AX染色并进行FACS分析。显示了平均γ-H2AX信号。d日GFI1过表达的SupT1细胞和载体对照被视为c（c）.e（电子）左图：用编码Cas9的质粒、靶向Lamin A基因座的两个gRNA之一和供体质粒对具有GFI1 KO的Jurkat细胞和亲本对照细胞进行电穿孔。没有gRNA的电穿孔细胞显示为对照。右图：显示三叶草信号与侧面散射的典型FACS剖面。用无gRNA质粒电穿孔细胞测定阳性门
图3
图3
GFI1与参与DDR的蛋白质相互作用。一从293T细胞中免疫沉淀GFI1-Flag融合蛋白。共沉淀蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用考马斯蓝染色。b条MRE11的肽序列，通过质谱鉴定的肽突出显示，相应的光谱如下。c（c）PRMT1的肽序列，通过质谱鉴定的肽突出显示，相应的光谱如下。d日从293T细胞中免疫沉淀GFI1-Flag融合蛋白的变体。通过SDS–PAGE对提取物进行分离，并对所指示的蛋白质进行印迹。e（电子）不同GFI1融合蛋白用于d日和克. （f）在存在或不存在苯酶的情况下，GFI1-Flag融合蛋白在293T细胞中免疫沉淀。提取物通过SDS-PAGE分离，并进行MRE11印迹。克用表达GFI1变体结构的质粒电穿孔GFI1 KO Jurkat细胞，如e（电子）GFI1 KO和亲代对照Jurkat细胞作为对照。24天后 h、 细胞暴露于5 Gy IR并允许在指定时间内恢复。用碱性彗星试验对细胞进行裂解和分析。彗星尾矩平均值如图所示。显示了三个重复实验中的一个。误差线代表s.d。小时内源性GFI1蛋白在SupT1细胞中免疫沉淀。用SDS-PAGE分离共沉淀蛋白，并对MRE11和PRMT1进行印迹。我内源性GFI1蛋白在Jurkat细胞中免疫沉淀。用SDS-PAGE分离共沉淀蛋白，并对MRE11和PRMT1进行印迹
图4
图4
GFI1活性与DNA损伤无关。一用5 Gy IR并允许在指定的时间内恢复。通过SDS-PAGE分离提取物，并对所示蛋白质进行印迹。b条将SupT1细胞铺在玻片上15 最小值和1 使用细胞分裂素照射后h，对内源性Gfi1和γ-H2AX进行染色，并通过共焦显微镜观察免疫荧光。对照细胞染色无一级抗体，但有二级抗体。c（c）携带LacO阵列并表达LacR-Fok1-mCherry核酸内切酶的U2OS细胞被转染表达GFI1-GFP融合蛋白的载体。这些细胞被镀在盖玻片上，进行γ-H2AX染色，并通过共焦显微镜观察免疫荧光。d日将表达GFI1-GFP融合蛋白的U2OS细胞暴露于405 通过共焦显微镜定量纳米紫外微辐射和GFI1-GFP融合蛋白向损伤部位的募集。平均信号强度以误差条表示。Ku80-mRuby2融合蛋白和GFP蛋白的招募显示为对照。选定时间点的代表性图像显示在右侧。比例尺代表10 微米
图5
图5
GFI1介导MRE11的PRMT1依赖性甲基化。一核提取物是从胸腺细胞中提取的Gfi1公司WT鼠标和匹配Gfi1公司KO小鼠。从这些提取物中免疫沉淀MRE11，用SDS–PAGE分离蛋白质并进行ADMA印迹。输入细胞提取物上的控制斑点如下所示。b条从过度表达GFI1的SupT1细胞和载体控制细胞制备核提取物，并免疫沉淀MRE11，用SDS-PAGE分离并印迹ADMA。c（c）按照中所述制备提取物一对PRMT1进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分离，并对MRE11进行印迹。d日按照中所述制备提取物一对MRE11进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分离，并对PRMT1进行印迹。e（电子）按照中所述制备提取物b条对PRMT1进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分离，并对MRE11进行印迹。（f）按照中所述制备提取物b条对MRE11进行免疫沉淀，用SDS-PAGE分离，并对PRMT1进行印迹。克胸腺细胞核提取物Gfi1公司WT鼠标和匹配Gfi1公司采用SDS-PAGE分离KO小鼠，并进行ADMA印迹。小时从过度表达GFI1的SupT1细胞和载体控制细胞中制备核提取物，并通过SDS-PAGE分离和印迹ADMA
图6
图6
GFI1在DNA修复中的作用是通过PRMT1活性介导的。一从表达MRE11 R/K突变形式的MEF和野生型对照细胞制备核提取物。对提取物进行MRE11免疫沉淀和ADMA印迹。b条表达R/K突变型MRE11的MEF和野生型对照细胞暴露于5 Gy-IR，并允许在所指示的时间内恢复。然后用碱性彗星试验对细胞进行裂解和分析。彗星尾矩平均值如图所示。显示了三个重复实验中的一个。误差线代表s.d*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 韦尔奇校正后的0.001吨-测试。c（c）GFI1 KO Jurkat细胞和亲代对照细胞治疗48 500小时 nM MS023抑制剂。然后对核提取物进行MRE11免疫沉淀和ADMA印迹。d日GFI1 KO Jurkat细胞和亲代对照细胞（左）以及过表达GFI1的SupT1和载体对照细胞（右）用500 nM MS023抑制剂或载体以每毫升100万个细胞接种，并暴露于5 Gy IR。第二天对细胞进行计数。虚线表示平均细胞数，并显示了三次重复实验的单个数据点。e（电子）单元格，如中所示d日暴露于5 Gy IR并允许在指定时间内恢复。然后用彗星试验分析细胞，如b条.（f）使用针对PRMT1的siRNA对SupT1过度表达的GFI1和载体控制细胞进行电穿孔。电泳细胞经FACS分类24 小时后。24小时后，细胞暴露于5 Gy IR，允许在指定时间内恢复，然后通过碱性彗星分析进行分析，如b条. 克GFI1 KO Jurkat细胞和亲代对照细胞按（f）并通过碱性彗星试验进行分析b条. 小时用表达PRMT1的pcDNA3.1质粒或载体对照电穿孔GFI1 KO Jurkat细胞和亲代对照细胞。电泳细胞经FACS分类24 小时后。24小时后，细胞暴露于5 Gy IR，允许在指定时间内恢复，然后通过碱性彗星分析进行分析，如b条
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