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.2018年6月1日；27(11):1927-1940.
doi:10.1093/hmg/ddy101。

SNX14突变影响常染色体隐性遗传性脊髓小脑共济失调患者的内质网相关中性脂质代谢20

戴尔·布莱恩特 1, 杨柳 2, 桑查里·达塔 2, 哈娜·哈里里 2, 玛丽安·塞达 1, 格伦·安德森 三, 艾玛·佩斯科特 1, Charalambos Demetriou公司 1, 塞尔吉奥·索萨 4, 达根·詹金斯 1, 彼得·克莱顿 1, 玛丽亚·比特纳·格林兹茨 1, 古德伦·E·摩尔 1, W迈克·海恩 2, 菲利普·斯坦尼尔 1
附属公司

SNX14突变影响常染色体隐性遗传性脊髓小脑共济失调患者的内质网相关中性脂质代谢20

戴尔·布莱恩特等。 人类分子遗传学. .

摘要

SNX14突变导致常染色体隐性小脑共济失调20（SCAR20）。突变通常会导致蛋白质丢失，尽管也有一些编码区缺失的报道。患者来源的成纤维细胞显示自噬被破坏，但SNX14的确切功能尚不清楚。酵母同源物Mdm1在内质网-溶酶体/液泡-有机体间系留中发挥作用，但在哺乳动物中仍需保持功能。在这里，我们表明SNX14的缺失改变了自噬通量，但并没有阻断自噬流量。此外，我们发现SNX14是一种与ER相关的蛋白质，在中性脂质稳态和生物体间串扰中发挥作用。SNX14需要其N端跨膜螺旋来进行ER定位，而Phox同源性（PX）结构域对于亚细胞定位是不可或缺的。SNX14突变的成纤维细胞和SNX14KO HEK293细胞都积累了异常的细胞质空泡，表明溶酶体内稳态存在缺陷。然而，ER-late内体/溶酶体接触位点在SNX14KO细胞中保持不变，这表明它不是ER-内体栓系的先决条件。对SNX14-缺陷的进一步研究表明中性脂质代谢存在普遍缺陷。SNX14KO细胞在LAMP1阳性溶酶体结构中显示出明显的核周filipin积聚，表明胆固醇积聚。与此相一致，SNX14KO细胞胆固醇酯水平显示出轻微但可检测到的下降，U18666A加剧了这种下降。最后，SNX14与油酸盐处理后的ER衍生脂滴（LD）相关，表明在ER-LD串扰中起作用。因此，我们确定了SNX14在ER、溶酶体和LD之间中性脂质稳态中的重要作用，这可能为缓解SCAR20的临床症状提供早期干预靶点。

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数字

图1。
图1。
SNX14突变增强了对自噬诱导的反应。(A类)中的突变SNX14系列据报道导致SCAR20的基因。(B类)对照组和SCAR20患者皮肤成纤维细胞中SNX14蛋白的表达。中的突变SNX14系列该基因导致没有检测到SNX14蛋白（c2596C > T；p.Gln866*和c.1108 + 1181_2108–2342 del；p.Val369_Leu702del）或截断SNX14ΔPX蛋白质（c1894 + 1G个 > T；第A603_G632页）。(C类)对照和SCAR20患者来源的成纤维细胞在有或没有自噬诱导条件下培养6小时（250米Torin1或0.1%DMSO），其影响p62和LC3B-II的水平。(天)p62表达对Torin1治疗反应的倍数变化。(E类)Torin1治疗后LC3B-II表达的折叠变化。（D、E）n个 = 6，误差线 = 扫描电镜**P（P） ≤ 0.01纳秒P（P） ≥ 0.05，学生的t吨-测试。(F类)SNX14中EGFP和mCherry荧光强度的定量重量和SNX14击倒对手HEK293细胞在自噬诱导条件下培养，有或没有抑制溶酶体-自噬体与巴非霉素A的融合（50 n）米6小时）。N个 = 4–7（单元格），误差条 = 标准**P（P） ≤ 0.01，方差分析。
图2。
图2。
SNX14定位于内质网膜。(A类,B类)U2OS细胞中过度表达的SNX14显示出与ER相关HSP90B1类似的亚细胞分布（比例尺 = 10µm）。(C类)（B）中指定区域的线图，显示SNX14（绿色）和HSP90B1（红色）强度之间的关系。(天)U2OS细胞系表达SNX14-FLAG的N端或C端片段。(E类)SNX14-FLAG的N末端段主要负责膜结合。(F类)器官分馏揭示了N端和C端SNX14片段之间的不同分布。(G公司)hSNX14早期内体（EE）相关EEA1、晚期内体（LE）相关LAMP1和内质网（ER）相关核黄素的相对强度1-RGS公司-表达FLAG的U2OS细胞。(H（H）)SNX14的N端和C端片段的相对强度剖面显示出不同的分布剖面。
图3。
图3。
SCAR20患者的胆固醇积聚。(A类,B类)来自（A）对照组和（B）SCAR20患者的皮肤成纤维细胞的菲林染色显示，箭头（比例尺）表示核周强度增加 = 50µm）。(C类)来自对照组和SCAR20患者（p.Q866*）的菲林染色皮肤成纤维细胞显示，在U18666A治疗24小时后，菲林强度的核周分布增加（比例尺 = 200µm）。(天)量化每个细胞核周区的丝裂原强度。U18666A治疗加剧了SNX14突变成纤维细胞的核周胆固醇积聚。每个点代表一个单元格，n个 ≥ 143，巴 = 平均值，误差条 = 扫描电镜**P（P） ≤ 0.01，单因素方差分析。
图4。
图4。
SNX14突变细胞中胆固醇的核周堆积。CRISPR-Cas9介导靶向HEK293克隆单细胞分选产生的细胞裂解液中的SNX14蛋白SNX14系列基因。(A类,B类)克隆显示全长SNX14蛋白（SNX WT 1-6）、无SNX14蛋白质（SNX14 KO 1-7）或截短的SNX14蛋白酶（SNX14DEL 1-5）。培养细胞(C类)使用或(天)无23.5µ米U18666A处理24小时后，SNX14突变细胞显示出更大的胆固醇积累。(E类)U18666A增加了胆固醇的核周分布。(F类)与SNX14相比，经U18666A处理的SNX14突变克隆显示胆固醇的核周分布增加重量克隆。（C，D）比例尺 = 50微米。（E，F）filipin信号强度从核区到外围的平均径向分布，N个 = 6（SNX14重量克隆），N个 = 5（SNX14DEL公司克隆），N个 = 7（SNX14击倒对手克隆），点 = 平均值，误差线 = SD、**P（P） ≤ 0.01, *P（P） ≤ 0.05，不另说明。P（P） ≥ 0.05，学生的t吨-测试。
图5。
图5。
SNX14缺失导致自噬细胞器的大量积累。电子显微镜图像(A类,B类)SNX14系列重量和(C类–F类)SNX14系列击倒对手HEK293克隆。用23.5µ米U18666A处理前24小时。箭头表示含有未消化或部分消化物质的自噬结构。（E，F）在不存在SNX14的情况下，在自噬细胞器（伪红色）和内质网（伪蓝色）之间检测到的膜接触位点（箭头）的例子。（A、C）比例尺 = 1微米；（B，D）比例尺 = 10µm（E，F）比例尺 = 500纳米。
图6。
图6。
SNX14缺失会干扰内质网相关中性脂质代谢。(A类–天)SNX14中性脂质的薄层色谱分析重量和SNX14击倒对手培养的HEK293不含（A，B）或（C，D）外源性胆固醇（低密度脂蛋白；LDL）。（A） SNX14中胆固醇酯（CE）减少击倒对手细胞。（B） SNX14中三酰甘油酯（TAG）增加击倒对手细胞添加U18666A。（C） 当SNX14时，CE降低击倒对手用U18666A和LDL处理细胞。（D） SNX14中TAG水平增加击倒对手用U18666A和LDL培养的细胞。N个 = 2，误差线 = SD、**P（P） ≤ 0.01纳秒P（P） ≥ 0.05，学生的t吨-测试。(E类)免疫荧光图像U2OS系列未经处理或用600μ米油酸处理8小时后，观察到SNX14-FLAG（抗FLAG）在核周环状结构中积聚（箭头所示）。(F类)SNX14-FLAG（绿色）、ER标记HSP90B1（红色）和LD染色单丹酰戊烷（蓝色）的共荧光成像。比例尺 = 5微米。
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