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.2018年4月3日;8(1):5430.
doi:10.1038/s41598-018-23653-3。

体内血管再生的多步转录级联

附属公司

体内血管再生的多步转录级联

Aditya S Shirali公司等。 科学代表. .

摘要

血管再生和修复的分子机制尚不清楚。为了深入了解这一过程,我们开发了一种内膜剥脱方法,描述了内皮细胞愈合的过程,并进行了随时间推移的转录组分析。下一代RNA测序(RNAseq)在剥蚀损伤后的体内再生过程中提供了定量且无偏见的基因表达谱。我们的数据表明,损伤后不久,紧邻伤口的细胞会产生强大而快速的反应,上调Jun、Fos、Myc等基因以及细胞粘附基因。紧接着是一波增殖基因。内皮细胞愈合完成后,大量细胞外基质转录物上调。基因本体丰富和蛋白质网络分析用于识别随时间推移的转录谱。进一步的数据挖掘揭示了再生的四个不同阶段:休克、增殖、适应和成熟。这些阶段的转录特征提供了对正常生理条件下负责动脉修复的再生机制的见解。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
连续性主动脉阻断导致主动脉剥脱损伤。()小鼠主动脉阻断程序示意图。肾下腹主动脉从肾动脉下方至髂分叉处的顺序夹闭。(b条)随后于2时采集主动脉小时(n = 6), 72小时(n = 6) ,1周(n = 5) ,2周(n = 4) 和4周(n = 4) 剥蚀损伤后。(c(c))纵向横切主动脉并进行免疫组织化学(IHC)面对面. ()VE-cadherin(红色)识别无损伤主动脉的内皮单层和纤维蛋白原(绿色)IHC。(e(电子))主动脉交叉夹闭在2受伤后小时。((f))纤维蛋白原IHC显示剥脱区,VE钙粘蛋白在72小时(f)、1周(g)、2周(h)和4周(i)。白色横条表示原始剥蚀损伤长度。(d’–i’)装箱区域的放大倍数更高。比例尺:40μm。
图2
图2
内皮单层的再生以损伤后迅速开始的增殖为标志,并促进伤口闭合。()实验设计的示意图。向小鼠注射EdU 2主动脉切取前数小时。(b条)每1000个内皮细胞中无损伤的EdU阳性内皮细胞数量(平均值±SEM)(n = 6) 和2小时(n = 6), 72小时(n = 6) ,1周(n = 5) ,2周(n = 4) 和4周(n = 4) 受伤后。(c(c)小时)指示时间点损伤后EdU-阳性内皮细胞(绿色)。VE钙粘蛋白用于显示内皮连接(红色)。(c’–h’)高倍镜下,箱区的IHC显示72岁时EdU阳性内皮细胞受伤后1小时、1周和4周。比例尺:40微米。
图3
图3
转录组学分析确定与血管再生进展相关的独特转录特征。()主成分分析(PCA)证明了我们数据中的方差来源,并确定了伤口愈合的独特阶段:休克2小时(n = 5) ,72岁时增殖小时(n = 6) ,1周时适应(n = 6) 2周和4周时成熟(n = 两个时间点均为6),并向未损伤的主动脉转录物(n = 5). (b条)热图显示了根据正则化对数变换计算的样本之间的欧氏距离。(c(c))热图显示内皮、平滑肌、炎症和内务基因转录物的相对丰度。注意所有时间点内皮特异性标记物的富集。
图4
图4
初始损伤以细胞应激、转录调控和细胞粘附为特征。()基因本体丰富发现炎症反应和细胞粘附是显著上调的过程,除其他外,2受伤后小时。(b条)按折叠变化组织的前50个差异表达基因(由最低p值确定)。(c(c))热图显示无损伤(n)之间前50个差异表达基因的标准化计数差异 = 5) 和2小时(n = 5). ()通过STRING分析,前50个差异表达基因的蛋白质相互作用网络确定了特定于细胞应激和细胞粘附的簇。(e(电子))JunD表达式2免疫组化显示损伤后小时(绿色)。VE-cadherin和DAPI分别表示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm((f))JunB表达的免疫组织化学2受伤后小时(绿色)。VE-cadherin和DAPI分别显示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm。
图5
图5
显著增殖的特征是细胞周期转录物增强。()基因本体富集确定细胞周期、免疫系统过程和核小体组装是最显著上调的过程72受伤后小时。(b条)按折叠变化组织的前50个差异表达基因(由最低p值确定)。(c(c))热图显示无损伤(n)之间前50个差异表达基因的标准化计数差异 = 5) 和72小时(n = 6). ()通过STRING分析,前50个差异表达基因的蛋白质相互作用网络确定了增殖和炎症特异性蛋白簇。(e(电子))Ki67表达72伤后小时(绿色)免疫组化。VE-cadherin和DAPI分别表示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm((f))免疫组织化学显示Smc2表达72受伤后小时(绿色)。VE钙粘蛋白和DAPI分别显示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm。
图6
图6
驯化的特征是增强细胞粘附和炎症转录物。()在损伤后1周,基因本体丰富确定免疫系统过程、阳性细胞迁移和细胞粘附是前十个最重要的生物过程。(b条)按折叠变化组织的前50个差异表达基因(由最低p值确定)。(c(c))热图显示无损伤(n)之间前50个差异表达基因的标准化计数差异 = 5) 和1周(n = 6). ()通过STRING分析,前50个差异表达基因的蛋白质相互作用网络确定了一个特定于基底膜和细胞外基质沉积的簇。(e(电子))免疫细胞化学显示损伤后1周III型胶原表达增强(绿色)。VE-cadherin和DAPI分别表示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm((f))损伤后1周层粘连蛋白1表达的免疫细胞化学(绿色)。VE-cadherin和ERG分别表示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm。
图7
图7
最后阶段以细胞外基质转录物的升高为标志。()基因本体丰富发现,细胞粘附和细胞外基质组织是损伤后2周和4周的前两个生物过程。(b条)按折叠变化组织的前50个差异表达基因(由最低p值确定)。(c(c))热图显示无损伤(n)之间前50个差异表达基因的标准化计数差异 = 5) ,2周(n = 6) 、和4周(n = 6). ()通过STRING分析显示细胞外基质蛋白聚集的前50个差异表达基因的蛋白质相互作用网络。(e(电子))免疫组织化学显示损伤后2周弹性蛋白表达(绿色)。VE-cadherin和DAPI分别显示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm((f))免疫组织化学检测损伤后4周内皮素表达增强(绿色)。VE-cadherin和ERG分别表示内皮连接(红色)和细胞核(蓝色)。比例尺:60μm。
图8
图8
血管再生可分为四个不同的转录阶段,由细胞过程的独特变化定义。()RNAseq中确定的一组基因的差异表达热图,现在使用NanoString在创伤再生过程中的多个时间点对损伤后内膜丰富的主动脉样本进行验证(n = 17[未受伤],n = 30 [2受伤后小时],n = 17[72受伤后小时],n = 13[1周受伤后],n = 20[受伤后2周])。对于每个时间点,将动物数量分为三个独立的池,用于每个时间点的统计分析。统计数据包括假设方差不相等的对数转换归一化数据的双尾t检验。红色表示与未受损内膜丰富的主动脉样本相比上调;蓝色表示下调。(b条)压力和免疫反应、细胞信号传导、细胞迁移、细胞增殖、细胞外基质重组和血管成熟对每个转录阶段的贡献的示意图。根据每个阶段确定的前十个GO对细胞过程进行分类。较大的外圈表示该类别中所有具有统计意义的DEG的百分比,较深的内圈表示定义过程中高度表达的基因的比例(基本平均值 > 200计数)。内圈和外圈的总和是该特定类别在前10个GO类别中占总DEG的百分比。每行上所有圆圈的总和代表前10个类别中的所有DEG。

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