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.2018年6月22日；293(25):9662-9673.
doi:10.1074/jbc。M117.811737。 Epub 2018年4月2日。

这个沙门氏菌效应物SseF和SseG抑制Rab1A介导的自噬以促进细胞内细菌的存活和复制

赵中锋 1, 蒋安杰 1, 安文茂 1, 于汉峰 1, 王卫南（Weinan Wang） 1, 李晶晶 1, 张晓燕 1, 科兴 1, 薛鹏 2
附属公司

这个沙门氏菌效应物SseF和SseG抑制Rab1A介导的自噬以促进细胞内细菌的存活和复制

赵中锋等。 生物化学杂志. .

摘要

在哺乳动物细胞中，自噬在限制入侵细菌病原体的进一步传播方面起着至关重要的作用。以前的研究已经确定沙门氏菌毒力因子SseF和SseG是细胞内细菌生存和复制所必需的。然而，这两种效应物促进细菌感染的潜在机制仍然难以捉摸。在这里，我们报道了SseF和SseG由沙门氏菌鼠伤寒(美国。Typhimurium）抑制宿主细胞的自噬，从而为胞浆中的细菌建立复制生态位。从机制上讲，SseF和SseG通过直接与宿主细胞中的小GTPase Rab1A相互作用而损害自噬的启动。这种相互作用通过破坏与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用，即TRAPPIII（转运蛋白颗粒III）复合体，从而消除了Rab1A的活化。Rab1A信号传导的中断阻断了Unc-51样自噬激活激酶1（ULK1）的募集和激活，并降低了磷脂酰肌醇3-磷酸的生物生成，最终阻碍了自噬体的形成。此外，SseF-或SseG-缺陷细菌菌株在哺乳动物细胞系和小鼠感染模型中的存活和生长都降低，而Rab1A缺失可以挽救这些缺陷。这些结果表明，毒力因子依赖的小GTPase Rab1A失活代表了以前未被认识的S公司伤寒病毒可以逃避自噬和宿主防御系统。

关键词：拉布；肠道沙门菌；自噬；宿主-猪相互作用；毒力因子。

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利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突

数字

图1。
图1。
SseF和SseG减弱细胞自噬的启动。 A类体外表达HA-SseF或HA-SseG的HeLa细胞系中LC3-II和p62水平的Western blot分析；矢量表示控制单元线。数据显示为平均值±S.D(误差线) (**,对< 0.01; *,对< 0.05).B类、Western blot分析体外表达HA-GST（GSH）的RAW264.7细胞系的自噬活性S公司-转移酶）、HA-SseF或SseG。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).C类Western blot分析表达HA-SseF或空载体的Hela细胞的自噬活性。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).D类共聚焦显微镜分析LC3阳性自噬膜结构。比例尺，10微米。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).D类，根据LC3点的相对平均数进行定量。E类透射电镜进一步检测自噬活性。黑色箭头表明自噬空泡；N个，细胞核。根据每个细胞自噬液泡的平均数量进行定量。比例尺，1μm。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).F类共聚焦显微镜分析Atg16L阳性自噬膜结构。根据Atg16L点的相对平均数进行量化。比例尺，10微米。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).
图2。
图2。
SseF和SseG与Rab1A相关。 A类，将Rab1A确定为SseF的交互作用者。用抗HA微球共免疫沉淀SseF的潜在细胞结合伙伴，用SDS-PAGE和MS洗脱和分析蛋白复合物。WCL公司，全细胞裂解物。B类，Rab1A在生理条件下与SseF或SseG相互作用。沙门氏菌用HA-标记的SseF和SseG替换SseF或SseG基因位点。将所得菌株用于感染巨噬细胞系RAW264.7。与HA标记的SseF或SseG相关的细胞蛋白复合物共同免疫沉淀，并通过Western blotting进行分析(工作分解结构).WCL公司，全细胞裂解物。C类，测试SseF与不同形式Rab1A之间的相互作用。将FLAG标记的Rab1A-WT、Rab1A-Q70L（GTP-bound mimetics）或Rab1S-S25N（GDP-bounded mimetics）转染到稳定表达HA-SseF或HA-SseG的细胞中。进行Co-IP和Western blot分析。数据显示为平均值±S.D(误差线) (*,对< 0.05).D类，使用中描述的协议测试SseG和不同形式的Rab1A之间的相互作用C类数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).E类纯化GST-tagged Rab1A-WT、Rab1A-Q70L或Rab1S-S25N的重组蛋白。F类纯化HeLa细胞中HA-标记的SseF和SseG重组蛋白。G公司,在体外GST下拉试验。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).H（H），如图所示，从细胞裂解物中纯化重组GST-GDI1下拉物Rab1A。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).我，SseF和SseG的亚细胞定位。共聚焦显微镜分析用于可视化SseF和SseG的定位。重叠百分比的量化。
图3。
图3。
SseF和SseG抑制mTRAPPIII介导的Rab1A激活。 A类，mTRAPPIII和Rab1A在SseF或SseG存在下的相互作用。用抗mTrs85抗体的co-IP法测定表达HA-SseF或HA-SseG的细胞中mTRAPPIII和Rab1A的相关性，并用Western blotting分析免疫沉淀蛋白复合物。数据显示为平均值±S.D(误差线) (**,对< 0.01).B类，将重组Rab1A与从HeLa细胞纯化的mTRAPPIII复合物孵育，然后向反应中添加GTPγS。为了测试SseF或SseG的抑制作用，首先将重组Rab1A与mTRAPPIII复合物孵育，然后将纯化的重组SseF和SseG添加到反应中，然后添加GTPγS。通过测定不同时间点的GTPγS，测定Rab1A的鸟嘌呤核苷酸交换活性。C类为了以剂量依赖性的方式测试SseF或SseG的抑制作用，首先将重组Rab1A与mTRAPPIII复合物孵育，然后将纯化的重组SseF和SseG以不同比例添加到反应中与Rab1A，随后添加GTPγS。通过测定不同时间点的GTPγS，测定Rab1A的鸟嘌呤核苷酸交换活性，并计算相对GTPγS负荷。
图4。
图4。
SseF和SseG损害Rab1A介导的ULK1募集和激活。 A类在存在SseF或SseG的情况下，ULK1和Rab1A的相互作用。如图所示，通过co-IP和Western blotting使用抗体分析表达HA-SseF或HA-SseG的细胞中ULK1和Rab1A的相关性。数据显示为平均值±S.D(误差线) (*,对< 0.05).B类细菌感染下C9orf72和Rab1A的相互作用。如图所示，用co-IP和Western blotting抗体测定细菌感染细胞中C9orf72和Rab1A的相关性。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05).WCL公司，全细胞裂解物。C类共聚焦显微镜分析ULK1阳性自噬膜结构。D类，根据中显示的ULK1点状平均数进行量化C.比例尺，10微米。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).E类共聚焦显微镜分析Atg13阳性自噬膜结构。比例尺，10微米。F类，根据中显示的Atg13点的平均数量进行量化E类数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).G公司，磷酸化Belin1（Ser-15）的Western blot分析。数据显示为平均值±S.D.（*，对< 0.05; **,对< 0.01).
图5。
图5。
SseF和SseG影响自噬途径中ULK1下游信号传导。 A类，在存在SseF或SseG的情况下PI3P的生物成因。通过将PI3P探针GFP-FYVE2低水平转染细胞，检测表达HA-SseF或HA-SseG的细胞中PI3P的生物生成。共聚焦显微镜分析用于量化GFP-FYVE2阳性点状物，如图所示B.比例尺，10微米。数据显示为平均值±S.D(误差线) (*,对< 0.05).C类，通过ELISA测定细胞PI3P水平。按照制造商的说明进行ELISA。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01; *,对< 0.05).D类共聚焦显微镜分析Atg2阳性膜结构。HeLa细胞在盖玻片上生长，固定和渗透后，以抗Atg2抗体作为一级抗体，Alexa Fluor 488结合IgG作为二级抗体依次染色。Atg2 punta的平均数量被量化并显示在E.比例尺，10微米。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).
图6。
图6。
SseF和SseG拮抗Rab1A介导的细胞内细菌复制自噬。 A类，在RAW264.7细胞系中敲除Rab1A。B类，SseF和SseG在细胞内增殖中的作用S公司.伤寒杆菌。RAW264.7巨噬细胞感染美国。Typhimurium WT和各种突变株的多重感染率约为5。清洗细胞外细菌，然后添加庆大霉素以杀死剩余的细菌。在感染后2和12小时，对细胞进行裂解，并测定细胞内cfu的数量。细胞内复制表现为感染后2至12小时内细胞内CFU增加。首先通过细胞内cfu在2小时时增加-倍进行量化与感染后12小时，WT RAW264.7细胞感染WT后的细胞数进一步恢复正常沙门氏菌应变。数据显示为平均值±S.D(误差线) (**,对< 0.01;纳秒，无意义）。C类，在RAW264.7细胞系中敲低Rab6。D类，按照B类数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).E类，建立过度表达Rab1A、Rab6A或Rab33B的RAW264.7细胞系。感染检测按照B.F.公司，数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.01).
图7。
图7。
Rab1A介导的自噬是限制沙门氏菌在小鼠模型中。 A类，用于Rab1A的小鼠胚胎成纤维细胞系+/+和Rab1A−/−用抗Rab1A、LC3、p62或肌动蛋白作为一级抗体，辣根过氧化物酶结合IgG作为二级抗体，通过Western blotting分析Rab1A，LC3-I，LC3-II和p62的细胞水平。B类、WT或ΔSseF沙门氏菌应用该菌株感染小鼠，分离小肠进行Western blot分析。数据显示为平均值±S.D.（**，对< 0.05).C类、C57BL/6-或Rab1A缺陷小鼠腹腔内感染102不同菌株的cfuS公司如上所示，感染后4天，计数感染小鼠脾脏中不同菌株的水平。每个钻石代表单个动物的细菌负荷，以及水平钢筋指示cfu的中位数。重要的对显示了通过威尔科森-曼恩-惠特尼试验确定的指示条件之间的细菌负荷差异值。
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