跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2018年3月29日；8(1):5368.
doi:10.1038/s41598-018-23690-y。

EXD2外切酶的线粒体外膜位置与其在核DNA修复中的直接作用相矛盾

芬娜·亨森 1, 阿曼丁·莫尔顿 2, 塞尔玛·范·埃斯维尔德 三, 盖拉丁·法奇 2, 约翰内斯·斯佩尔布林克 4
附属公司

EXD2外切酶的线粒体外膜位置与其在核DNA修复中的直接作用相矛盾

芬娜·亨森等。 科学代表. .

摘要

EXD2是最近发现的一种与核双链断裂修复有关的外切酶。鉴于我们对线粒体DNA维护的长期兴趣，以及EXD2也可能是线粒体蛋白的迹象，我们试图确定其细胞定位和可能的线粒体相关功能。我们的结果表明，EXD2确实显示线粒体定位，但令人惊讶的是，它主要与线粒体外膜有关。梯度纯化的细胞核仅显示EXD2存在的最微弱迹象，而预测的全长蛋白的过度表达显示了线粒体的专属定位。重要的是，通过X射线照射或Zeocin治疗诱导双链DNA断裂并不支持EXD2在双链断裂后重新定位到细胞核的观点，因此不太可能在细胞核DNA修复中发挥直接作用。EXD2的敲除或过度表达影响线粒体的细胞分布。这些结果表明，在EXD2缺失后报告的核DNA修复缺陷可能是线粒体动力学和/或功能改变的间接结果。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
EXD2是一种线粒体外膜相关蛋白。通过差速离心分离的U2OS细胞粗线粒体和在碘克沙醇梯度上分离的纯核在对照siRNA和EXD2 siRNA处理的细胞中检测EXD2丰度（面板a1）。结果表明，与线粒体标记蛋白mtSSB和孔蛋白相似的EXD2绝大多数存在于线粒体部分，而不是核部分，其中核标记物核磷蛋白被鉴定。SiRNA治疗证实全长（fl）~70的一致性 kDa EXD2蛋白和30种低丰度物种 kDa和更高的分子量。用三个商业siRNA的组合池或每个单独的siRNA进行敲除，在Western blots上U2OS细胞的总细胞裂解物中显示出类似的敲除效率（面板a2）。同时，还鉴定了几个较低分子量的EXD2物种，它们似乎对每个单独的siRNA都同样敏感，这表明它们可能是分解或加工的EXD2形式。蛋白酶保护表明线粒体EXD2主要存在于线粒体外膜（图b）。用蛋白酶K（ProtK）单独处理HEK293细胞的线粒体和洋地黄素来源的有丝分裂体，或用蛋白酶K和Triton-X100（TX100）处理线粒体和洋地黄素源的有丝裂体，以溶解内外膜。结果表明，虽然TFAM是一种线粒体DNA相关蛋白，在缺乏TX100的情况下可以免受ProtK的保护，但EXD2则没有，这表明存在外膜定位*表示用针对不同线粒体候选蛋白的抗体探测的残余信号，与本文无关。阿娜2一氧化碳三从HEK293细胞中提取的粗线粒体（图c）表明，与细胞色素类似c（c）氧化酶亚基I（一种完整的膜蛋白），全长EXD2主要存在于颗粒（膜）部分，而HSP60的大部分存在于上清液（非膜）部分。对于每个面板（除面板b外），裁剪后的图像显示了在相同的印迹上用后续抗体进行孵化的结果，用分割线表示（有关完整印迹图像，请参阅补充信息）。
图2
图2
全长EXD2在U2OS细胞中的敲除或过度表达证实了EXD2的线粒体定位。ProteinAtlas将我们在整个研究中使用的EXD2抗体描述为具有线粒体和可能的中间丝定位。为了测试其抗体的定位和有效性，我们测试了EXD2抗体，以及针对外膜蛋白Tomm20的抗体和针对中间丝蛋白波形蛋白（Vim）的抗体在转染非靶向对照siRNA池或三个EXD2隐形siRNA池后使用免疫荧光（a组）。在对照siRNA细胞中与Tomm20和vimentin共染色显示EXD2信号与线粒体和中间丝信号共定位。EXD2 siRNA处理表明，虽然EXD2线粒体信号不再被观察到，但中间丝信号仍然表明该信号不是非特异性的，或者所使用的siRNA池不会影响与中间丝相关的EXD2。预测的全长蛋白的瞬时过表达，无论是不带标记还是带有C末端组合的Myc/FLAG标记，都显示了Tomm20共染色所示的该蛋白的专属线粒体定位，而较高水平的过表达导致线粒体核周聚集（面板b）。随着过度表达，整个线粒体网络在一个大的核周簇中崩溃，失去了任何典型的线粒体网络样结构（补充图S1）。过度表达的全长EXD2没有核或中间丝定位的证据。请注意，本图中的图像是特意选择的，以最好地说明EXD2的线粒体定位。因此，我们选择了图像视图来显示线粒体网络清晰且延伸的细胞，同时试图避免线粒体网络浓缩/塌陷的细胞。
图3
图3
EXD2可在免疫荧光中加入抗体而无需线粒体溶解。多聚甲醛固定后的免疫荧光检测需要使用例如Triton X100进行线粒体裂解。在没有这种裂解步骤的情况下，线粒体基质蛋白和例如线粒体DNA是无法检测到的。因此（面板a）结果表明，在没有TX100裂解的情况下，EXD2被检测到，而IF既没有检测到MRPL12，也没有检测到mtDNA。在TX100分解中，三者都被检测到。类似的实验（面板b）表明，在没有TX100裂解的情况下检测到Tomm20和EXD2，但没有检测到mtDNA。高分辨率20 × 30 使用EXD2和MRPL12抗体的细胞µM亚区表明，EXD2信号通常包裹MRPL12信号（面板c：一些示例由合并图像中的白色箭头指示），进一步说明EXD2的外膜定位。
图4
图4
SiRNA介导的U2OS细胞中EXD2的敲除导致线粒体网络更为广泛。为了了解EXD2敲除对线粒体网络行为的可能影响，我们用EdU标记细胞，以识别S期细胞，为了了解细胞周期介导的线粒体网络动力学效应导致的镶嵌现象（见正文）。为此，细胞被培养30 转染后使用EdU的时间为min，48–60 用非靶向对照siRNA库（Csi）或三个EXD2隐形siRNA库（EXD2si3x）孵育小时。在标记EdU掺入物（绿色，gr）后，用Tomm20（红色，r）和EXD2（白色）抗体进一步标记细胞。对照siRNA处理的细胞显示出线粒体网络的频繁且强烈的核周聚集，特别是在EdU阳性细胞中。相比之下，EXD2si3x通常显示一个分布更广、有时更为复杂的网络。每个条件显示两个视场。
图5
图5
核DNA损伤不会将EXD2重新定位到核。（a组）HeLa细胞用13 Gy X射线照射诱发核DNA损伤并允许恢复30 分钟。结果表明，这种损伤后，细胞核中H2AX磷酸化显著增加，而EXD2保留其主要的线粒体定位，类似于其在对照细胞中的位置。（b组）U2OS细胞用250 μg/ml Zeocin 1次 小时，并允许恢复1 用常规培养基替换含Zeocin的培养基后hr。然后处理细胞进行γH2AX和EXD2的IF检测，结果与X射线照射HeLa细胞的结果相似。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Biehs R等。DNA双链断裂切除发生在G1非同源末端连接期间，但与同源重组期间的切除不同。分子细胞。2017;65:671–684 e675。doi:10.1016/j.molcel.2016.12.016。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Broderick R等。EXD2通过促进DNA末端切除促进同源重组。自然细胞生物学。2016;18:271–280. doi:10.1038/ncb3303。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Nieminszczy J、Broderick R、Niedzwiedz W.EXD2——一名新球员加入DSB切除团队。细胞周期。2016;15:1519–1520。doi:10.1080/15384101.2016.1161997。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Moretton A等。双链断裂后的选择性线粒体DNA降解。公共科学图书馆一号。2017;12:e0176795。doi:10.1371/journal.pone.0176795。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Rajala N、Gerhold JM、Martinsson P、Klymov A、Spelbrink JN。复制因子与线粒体内膜上的线粒体DNA暂时相关，以促进复制。2014年《核酸研究》；42:952–967. doi:10.1093/nar/gkt988。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型