Hypoxic-induced truncation of voltage-dependent anion channel 1 is mediated by both asparagine endopeptidase and calpain 1 activities

doi:10.18632/oncotarget.24377

.2018年1月31日；9(16):12825-12841.

doi:10.18632/目标24377。 eCollection 2018年2月27日。

缺氧诱导电压依赖性阴离子通道1的截断由天冬酰胺内肽酶和钙蛋白酶1活性介导

附属公司

¹内盖夫生命科学系和国家生物技术研究所，内盖夫Ben-Gurion大学，Beer-Sheva 84105，以色列。
²卡塔尼亚大学生物医学和生物技术系和国家生物膜和生物系统研究所，卡塔尼亚科，卡塔尼亚95125，意大利。
^三卡塔尼亚大学生物、地质和环境科学系，卡塔尼亚95125，意大利。
⁴尼斯癌症和衰老研究所，尼斯索菲亚·安蒂波利斯大学，安托万·拉卡萨涅中心，法国尼斯06189。
⁵当前地址：INSERM U1065，C3M，Nice 06204，France。

^#贡献均等。

PMID： 29560113
预防性维修识别码：项目经理5849177
内政部： 10.18632/目标24377

缺氧诱导电压依赖性阴离子通道1的截断由天冬酰胺内肽酶和钙蛋白酶1活性介导

哈达斯·帕希马等。 Oncotarget公司. 2018.

.2018年1月31日；9(16):12825-12841.

doi:10.18632/目标24377。 eCollection 2018年2月27日。

附属公司

¹内盖夫生命科学系和国家生物技术研究所，内盖夫Ben-Gurion大学，Beer-Sheva 84105，以色列。
²卡塔尼亚大学生物医学和生物技术系和国家生物膜和生物系统研究所，卡塔尼亚科，卡塔尼亚95125，意大利。
^三卡塔尼亚大学生物、地质和环境科学系，卡塔尼亚95125，意大利。
⁴尼斯癌症和衰老研究所，尼斯索菲亚·安蒂波利斯大学，安托万·拉卡萨涅中心，法国尼斯06189。
⁵当前地址：INSERM U1065，C3M，Nice 06204，France。

^#贡献均等。

PMID： 29560113
预防性维修识别码：项目经理5849177
内政部： 10.18632/目标24377

摘要

电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是一种外线粒体膜（OMM）蛋白，起着线粒体守门人的作用，介导核苷酸、钙的转运²⁺OMM中的其他代谢物。VDAC1还通过促进凋亡蛋白的释放以及与促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的结合，在线粒体介导的凋亡中发挥中心作用。肿瘤细胞经常暴露在缺氧条件下，通过诱导转录活性的转录因子低氧诱导因子（HIF）影响细胞。在培养细胞和肺癌患者中，缺氧诱导VDAC1在C末端截短（VDAC1-ΔC）。然而，VDAC1-ΔC形成的分子机制尚不清楚。这里，我们表明低氧诱导的VDAC1-ΔC的形成受到钙离子的抑制²⁺螯合剂BAPTA-AM、钙蛋白酶抑制剂-1、天冬酰胺内肽酶抑制剂（AEP）和靶向HIF1-α或钙的si-RNA²⁺-活化蛋白酶calpain-1的表达，但不表达calpain-2。最后，在细菌中表达并重组为平面脂质双层的VDAC1-ΔC相对于全长蛋白质表现出降低的通道电导，但保留了电压依赖性电导。这些发现表明，缺氧通过HIF-1α表达作用，导致VDAC1分裂，涉及钙蛋白酶1和AEP的激活。

关键词：VDAC1；天冬酰胺内肽酶；钙蛋白酶；缺氧。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

**图1。CoCl诱导的缺氧₂或低氧，导致VDAC1截断**
(A类)HeLa细胞在无血清DMEM中培养过夜，然后添加不同浓度的CoCl₂持续24小时。样品进行SDS-PAGE，然后使用抗体进行免疫印迹针对VDAC1的N端域。(B类)定量分析使用多规进行的三个独立实验的结果软件并以相对单位表示。(C类). HeLa细胞暴露于1%O₂48h后进行免疫印迹分析。(天)HeLa细胞在无血清DMEM中培养16小时，然后添加150μM CoCl₂在不同的时间，以及通过免疫印迹分析，使用抗HIF1-α或抗VDAC1抗体。(E类)HIF1-α和VDAC1-ΔC水平为分析并以相对单位表示。(F类)HeLa细胞暴露于1%O₂在指定的时间内，然后通过使用抗HIF1-α或抗VDAC1抗体进行免疫印迹。(**G公司**)VDAC1-ΔC和HIF1-α水平的量化为相对于每个蛋白质的最大水平，定义为1.0，以及归一化为β-actin水平。三个类似实验的代表如图所示。(**H（H）**)HeLa细胞在缺氧条件下处理（1%O₂)使用50、100或200 nM的si-RNA，针对HIF1-α，并通过使用特定抗体进行免疫印迹。

**图2。BAPTA-AM抑制VDAC1-ΔC的形成**
(A类)HeLa细胞在无血清DMEM中培养24小时150μM氯化钴₂以及BAPTA-AM的指示浓度，免疫印迹法检测VDAC1-ΔC的形成。A类给出了典型实验。(B类)结果是相对于β-肌动蛋白水平进行量化，并以相对值表示单位（RU）。(C类)HeLa细胞暴露于1%O₂在不存在或存在指示浓度的BAPTA-AM的情况下持续48小时，免疫印迹并分析VDAC1-ΔC水平(天).(E类)转染HeLa细胞以表达钙²⁺实验中描述的指示剂GCaMP5程序和转染后24小时在常氧或缺氧条件下生长条件。分析暴露于常氧或缺氧条件下的细胞12、24和48小时后，使用抗VDAC1形成VDAC1-ΔC抗体(E类)或使用荧光显微镜(F类). 如有指示，细胞处于常压状态将条件与离子霉素（5μM）孵育15分钟，然后可视化。

**图3。钙蛋白酶抑制剂I和抗钙蛋白酶1的siRNA抑制VDAC1-ΔC的形成**
(A类)HeLa细胞在无血清培养基中培养24小时或不含150μM CoCl₂并且在没有或在场的情况下钙蛋白酶抑制剂I的指示浓度（CI）。VDAC1-ΔC水平通过免疫印迹分析（见C）。(B类)免疫印迹法细胞在1%O中培养₂在没有或存在CI的情况下。(C类)VDAC1-ΔC水平的量化（A，完全圈）和（B，空圈），相对于β-肌动蛋白水平。(天)HeLa细胞在缺氧条件下处理（1%）₂)48小时，50或100 nM的si-RNA钙蛋白酶-1（si-Calp-1）或钙蛋白酶-2（si-Celp-2）并分析VDAC1，用免疫印迹法测定VDAC1（ΔC）、钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2水平特异性抗体。(E类)VDAC1水平的定量分析来自（D）中的三个类似实验。(F类)定量calpain-1（黑条）和calpain-2（灰条）水平分析。这个结果是（A）中五个类似实验的平均值±SE。^**P（P）*≤ .0.01,^***P（P）*≤.001；^****P（P）*≤ .0001.

**图4。AEP抑制剂抑制VDAC1-ΔC的形成**
(A类)暴露于1%O的HeLa细胞₂在没有或存在指定浓度的AEP抑制剂（AEP-I），免疫印迹并分析VDAC1-ΔC水平。(B类)根据（A）中的三个类似实验对VDAC1水平进行定量分析。(C类)将纯化的钙蛋白酶-1与20或40μM的AEP-I或10μM CI持续5分钟，钙蛋白酶活性分析如下如实验程序中所述。(天)HeLa细胞暴露于1%O₂在没有或存在指示的情况下持续24小时AEP-I浓度，然后按照实验程序。结果为平均值±SEM(n个= 3)^**P（P）*≤.0.01,^***P（P）*≤.001;^****P（P）*≤.0001.

**图5。重组C-末端截短VDAC1的表达**
(A类)VDAC1膜拓扑模型提出了所提出的钙蛋白酶解理位点（红色箭头）。生成的两个截短的VDAC1版本是VDAC1（Δ229-283），删除β-链15至19（VDAC1（Δβ15-19））和VDAC1删除β链16至19（VDAC1（Δβ16-19））。(B类)用质粒pcDNA3.1转染HEK-293细胞编码VDAC1（0.6 mg）、VDAC1VDAC1（Δβ16-19）（1或2 mg），使用磷酸钙。的表达式转染后24h用免疫印迹法分析重组蛋白。(C类)表达截短VDAC1结构的HEK-293细胞转染后24小时胰蛋白酶化，用PBS洗涤，并将蛋白质用LDAO（2%）或Triton X-100（3%）溶解，如实验程序。获得的上清液（S）和颗粒（P）如下在20000g离心时分析不同VDAC1的存在免疫印迹法检测。颗粒溶解在5%的原始体积，因此相对于上清液。(天)重组VDAC1考马斯蓝染色，VDAC1（Δβ15-19）和VDAC1细菌，并按照实验程序中所述进行纯化。分子量提出了标准。

**图6。重组全长和C末端截短VDAC1蛋白的通道特性**
重组和重折叠全长VDAC1的通道特性，重组VDAC1（Δβ15-19）和VDAC1到PLB中。(A类)VDAC1的代表性电流轨迹将其重组为DiphPC/正癸烷磷脂膜，在10 mV下记录25°C时，1 M KCl，10 mM HEPES，pH 7.0(B类)的直方图VDAC1电流振幅为10 mV。平均单通道电导值40次插入事件为3.5 nS。(C类)电流幅值变化在包含单个VDAC1通道的平面双层上响应线性电压在+50 mV和-50 mV之间倾斜双层膜两侧的浴液为1 M KCl，10 mM HEPES，pH 7.0。(天)电流-电压关系(我——*V（V）*曲线）。(E类)代表性电流轨迹PLB中的VDAC1（Δβ15-19）。条件如（A）所示。(F类)VDAC1的10 mV电流振幅直方图（Δβ15-19）。这个22次插入事件的平均单通道电导值为1.9 nS。(**G公司**)平面双层的电流振幅变化包含单个VDAC1（Δβ15-19）通道，以响应在+50 mV和-50 mV之间的线性电压斜坡。条件如下在（C）中。(**H（H）**)电流-电压关系(我——*V（V）*曲线）VDAC1（Δβ15-19）。(β15-19). (我)代表PLB中VDAC1（Δβ16-19）的电流迹线。条件如（A）所示。(J型)VDAC1（Δβ16-19）电流直方图10 mV时的振幅19个插入事件。(**K（K）**)平面上的电流振幅变化包含单个VDAC1（Δβ16-19）通道的双层响应于线性电压斜坡在+50 mV和-50 mV之间。条件为在（C）中。(**L（左）**)电流-电压关系(我——*V（V）*曲线）VDAC1（Δβ16-19）。(**M（M）**)电导和本文研究了三种VDAC1版本的蛋白质直径计算截短VDAC1版本的直径时，假设它们呈现相同的孔结构，每条链贡献4.3φ与周长之比。该数字是根据可用的VDAC1计算得出的由19条β链组成的结构，形成孔隙周长81.7º，直径26.0º（测量Ser46和Asn185之间）[–65]。因此，VDAC1（Δβ16-19]）的计算直径为21.9ÅVDAC1为20.5μl（Δβ15-19）。

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