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.2018年1月10日；9(14):11646-11664.
doi:10.18632/目标24126。 eCollection 2018年2月20日。

CdGAP/ARHGAP31受RSK磷酸化调节并与14-3-3β适配器蛋白结合

阿里·本·朱迪·乌阿达 1 2, 怡和 1 2, 维维安·卡拉布雷斯 三, 石井秀香 1 2, 罗尼·奇迪亚克 4, Jean-Philippe格拉顿 4, 菲利普·鲁克斯 三, 纳撒利·拉马克-范 1 2
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CdGAP/ARHGAP31受RSK磷酸化调节并与14-3-3β适配器蛋白结合

阿里·本·朱迪·乌阿达等。 Oncotarget公司. .

摘要

Cdc42 GTPase激活蛋白（CdGAP，也称为ARHGAP31）是GTPases Rac1和Cdc42的负调控因子。CdGAP与罕见的发育障碍Adams-Oliver综合征（AOS）相关，对胚胎血管发育和VEGF介导的血管生成至关重要。此外，CdGAP是乳腺癌细胞迁移和侵袭过程中TGFβ和ErbB-2信号通路之间协同作用的重要成分，是乳腺癌中与Zeb2的新型E-cadherin转录共抑制因子。CdGAP在丝氨酸和苏氨酸残基上高度磷酸化，以响应生长因子，是ERK1/2和GSK-3的底物。在这里，我们在CdGAP的C末端区域鉴定了Ser1093和Ser1163，它们被RSK磷酸化以响应佛波酯。这些磷残基为14-3-3衔接蛋白的结合创造了对接位点。CdGAP和14-3-3蛋白之间的相互作用抑制了CdGAP的GAP活性，并将CdGAP-隔离到细胞质中。因此，CdGAP的核质穿梭被抑制，CdGA诱导的细胞圆形被消除。此外，14-3-3β抑制CdGAP抑制E-cadherin启动子和诱导细胞迁移的能力。最后，我们发现14-3-3β无法调节缺乏这些磷酸酯类的AOS相关突变蛋白的活性和亚细胞定位。总之，我们提供了一种调控CdGAP活性和定位的新机制，这直接影响到更好地理解CdGAP作为乳腺癌促进剂的作用以及在AOS的分子病因中的作用。

关键词：14-3-3; RSK；RhoGAP；细胞骨架；磷酸化。

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利益冲突声明

利益冲突作者没有要披露的利益冲突。

数字

图1
图1。CdGAP被AGC家族激酶磷酸化，以响应生长因子和有丝分裂原
用TGFβ（5 ng/ml）刺激转染空载体（EV）或GFP-CdGAP的COS-7细胞(A、 B类)，FBS 20%(C、 D类)，或PMA（200 nM）(E、 F类). GFP-CdGAP蛋白从细胞裂解物中免疫沉淀（IP），用所示抗体免疫印迹检测共有基序RXRXXpS/T上的CdGAP（P-CdGA P）磷酸化。TCL，总细胞裂解物。（B，D，F）P-CdGAP/CdGAP比值的密度分析表示为相对于A、C和E刺激0分钟的倍数变化(*第页< 0.05,**第页<0.01，未成对学生t吨测试）。(G公司)内源性CdGAP是来自小鼠乳腺上皮（NMuMG）细胞裂解物的IP，用TGFβ（5 ng/ml）刺激30分钟，用抗CdGAP抗体或兔IgG作为对照。IP蛋白和总细胞裂解物（TCL）通过SDS-PAGE进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹。(H（H）)G中P-CdGAP/CdGAP比值的密度分析(*第页<0.05，未成对学生t吨测试）。(我)TGFβ（5ng/ml）刺激NMuMG细胞30min后，用SDS-PAGE分离总细胞裂解物（TCL），并用所示抗体进行免疫印迹。(J型)来自I的（P）-RSK/RSK的密度分析(**第页<0.01，未成对学生t吨测试）。
图2
图2。S1093和S1163是RSK依赖性磷酸化位点
(A类)如图所示，在存在或不存在RSK抑制剂BI-D1870的情况下，用PMA处理转染了空载体（EV）、野生型（WT）CdGAP或带有RSK1结构的CdGAP点突变体的COS-7细胞。GFP-CdGAP蛋白是来自总细胞裂解物（TCL）的IP。IP蛋白和TCL通过SDS-PAGE进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹。(B类)A.（P）-CdGAP/CdGAP的密度分析(*第页< 0.05,**第页<0.01，未成对学生t吨测试）。(C类)用所示的CdGAP构建物转染COS-7细胞，并按A。
图3
图3。14-3-3衔接蛋白亚型β和σ与CdGAP相互作用
(A类)用空载体（EV）或myc-CdGAP构建物转染HEK293细胞。用GST、GST-14-3-3e野生型（WT）或突变的14-3-3eK49E蛋白拖曳来自总细胞裂解物（TCL）的蛋白质。通过SDS-PAGE解析相关蛋白和TCL，并使用所示抗体进行免疫印迹分析。(B类和C类)如图所示，用myc-CdGAP和HA-14-3-3异构体转染HEK293细胞。Myc-CdGAP蛋白（B）或HA-14-3-3（C）是来自总细胞裂解物（TCL）的IP，通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗Myc和抗HA抗体进行免疫印迹。(天)CdGAP是来自MDA-MB-231细胞裂解物的IP，用TGFβ（5 ng/ml）刺激MDA-MB-231细胞，用抗CdGAP抗体或兔IgG作为对照。用所示抗体对IP蛋白和总细胞裂解物（输入）进行免疫印迹。
图4
图4。CdGAP和14-3-3β之间的相互作用需要依赖RSK的磷酸化残基S1093和S1163
(A类)小鼠CdGAP（mCdGAP）缺失突变体的示意图，包括主要RSK靶残基。+，多元残基拉伸；rhoGAP，GTPase激活蛋白；BR，基本区域；PRD，富含脯氨酸的结构域。(B类)用含HA-14-3-3β的空载体（EV）或GFP-CdGAP缺失突变体构建物转染COS-7细胞，并用PMA处理。GFP-CdGAP蛋白从总细胞裂解物（TCL）中免疫沉淀（IP）。IP蛋白和TCL通过SDS-PAGE进行解析，并用所示抗体进行免疫印迹。(C类和天)将HA-14-3-3β与所示CdGAP构建物转染COS-7细胞，并按B进行分析(E类)结合14-3-3β到CdGAP/来自D的总14-3-3α的密度分析(*第页<0.05，不另统计，不显著，未配对学生t吨测试）。
图5
图5。14-3-3β调节CdGAP亚细胞定位并抑制CdGAP-介导的细胞圆形
(A类)固定前将含有或不含14-3-3β的GFP-CdGAP构建物转染COS-7细胞。通过间接免疫荧光和共聚焦显微镜评估CdGAP和14-3-3β定位。分别用抗GFP、抗HA抗体和DAPI染色观察CdGAP（绿色）、14-3-3β（红色）和细胞核（蓝色）。棒，50μm。星形、圆形细胞、箭头、CdGAP的细胞质定位。(B类和C类)使用Metamorph软件手动计算GFP表达细胞呈现细胞圆形（B）或CdGAP核定位（C）的百分比。细胞核占细胞总面积≥50%的细胞被视为圆形，细胞核中GFP染色≥70%的细胞被认为是核定位细胞。至少在三个独立的实验中计数了100多个GFP阳性细胞。(**第页< 0.01,***第页<0.001，无统计学意义，未配对学生t吨测试）。(天)使用ZEN2010软件，使用Pearson相关系数（r）测量CdGAP与A中14-3-3β荧光强度之间的相关性。对来自三个独立实验的至少30个细胞进行了分析(***第页<0.001，未成对学生t吨测试）。
图6
图6。14-3-3β负调控CdGAP对Rac1的GAP活性
(A类)将pRK5-mycRac1与空载体（EV）、所示GFP-CdGAP构建物和所示HA-14-3-3β转染HEK293细胞。通过GST-CRIB从总蛋白裂解物（TCL）中提取GTP-负载的Rac1，通过免疫印迹检测GTP-结合Rac1和总Rac1蛋白。(B类)GTP-结合Rac1/总Rac1相对于A的EV的密度比(*第页< 0.05,**第页<0.01，n.s.，无显著性，未配对学生t吨测试）。
图7
图7。14-3-3β减少AOS相关CdGAP突变蛋白的相互作用和调节
(A类)如图所示，用HA-14-3-3β和空载体（EV）或myc-human CdGAP（hCdGAP）构建物转染COS-7细胞。Myc-hCdGAP蛋白是来自总细胞裂解物（TCL）的IP蛋白，通过SDS-PAGE进行解析，并使用抗Myc和抗HA抗体进行免疫印迹。hCdGAP-WT和AOS相关突变体的示意图。(B类)固定前将含有或不含14-3-3β的myc-hCdGAP构建物转染COS-7细胞。通过间接免疫荧光和共聚焦显微镜评估CdGAP和14-3-3β定位。分别用抗GFP、抗HA抗体和DAPI染色观察hCdGAP（绿色）、14-3-3β（红色）和细胞核（蓝色）。棒材，50μm。星形、圆形细胞、箭头、CdGAP的细胞质定位。（C和D）表达GFP的细胞呈圆形的百分比(C类)或hCdGAP核定位(天)使用Metamorph软件手动计算，如图5所示(*第页< 0.05,**第页< 0.01,***第页<0.001，未成对学生t吨测试）。(E类)使用ZEN2010软件，使用Pearson相关系数（r）测量B中hCdGAP和14-3-3β荧光强度之间的相关性。对来自三个独立实验的至少30个细胞进行了分析(*第页< 0.05,****第页<0.0001，未配对学生t吨测试）。
图8
图8。14-3-3β阻断CdGAP抑制E-cadherin启动子并诱导细胞迁移的能力
(A类)对转染空载体（EV）、HA-14-3-3β、野生型（WT）CdGAP或CdGAP点突变株的HEK293细胞进行E-cadherin启动子荧光素酶分析。数值是相对于用EV转染的HEK293细胞的数值(*第页< 0.05,**第页<0.001，不适用，不显著，未配对学生t吨测试）。(B类)A的总细胞裂解物（TCL）经SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行免疫印迹。(C类)对转染空载体（EV）、HA-14-3-3β或Myc-CdGAP的HEK293细胞进行迁移分析。(*第页<0.05，未成对学生t吨测试）。(天)通过SDS-PAGE解析来自C的总细胞裂解物，并用指示的抗体进行免疫印迹。
图9
图9。乳腺癌细胞中CdGAP以RSK1/2依赖方式在基本共识位点磷酸化
(A类)从转染空载体（vector）或14-3-3拮抗剂YPF-Difopein的MDA-MB-231细胞中分离出核（N）和细胞质（C）组分。用所示抗体对每一部分进行免疫印迹。Tubulin和Lamin B1分别用作细胞质和核组分的特异标记。(B类)内源性CdGAP从转染对照（CTL）siRNA或靶向RSK1/2的siRNA的MDA-MB-231细胞的总细胞裂解物（TCL）中免疫沉淀（IP），并用TGFβ（5 ng/ml）处理30分钟。IP蛋白和TCL通过SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行免疫印迹。(C类)B中（P）-CdGAP/CdGAP的密度分析(*第页< 0.05,**第页<0.01，未成对学生t吨测试）。
图10
图10。14-3-3衔接蛋白调控CdGAP的模型
(A类)作为对激动剂刺激的反应，CdGAP被Ser1093和Ser1163上的RSK磷酸化，这允许14-3-3蛋白的募集和结合。(B类)14-3-3/CdGAP相互作用抑制了CdGAP的核质穿梭，导致CdGAP在细胞质中的隔离，抑制GAP活性和E-cadherin阻遏。(C类)因此，Rac1-GTP水平升高，诱导细胞扩散，E-cadherin表达升高。
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