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.2018年5月14日；92（11）：e00364-18。
doi:10.128/JVI.00364-18。 2018年6月1日印刷。

干扰素α对感染传染性法氏囊病病毒细胞凋亡的影响

Liliana L古巴高纳 1, 伊丽莎白·迪亚兹·贝内泰兹 1, 玛丽娜·西斯卡 1, 何塞·F·罗德里格斯 1, 多洛雷斯·罗德里格斯 2
附属公司

干扰素α对感染传染性法氏囊病病毒细胞凋亡的影响

Liliana L古巴高纳等。 J维罗尔. .

摘要

传染性法氏囊病病毒（IBDV）属于病毒科是影响家鸡的一种高度传染性和免疫抑制性疾病（IBD）的病原体(五倍子). IBD或Gumboro病导致受感染动物的高发病率和死亡率，并对全球家禽业造成重大经济损失。IBD的特征是携带IgM的B淋巴细胞大量丢失和法氏囊破坏。IBDV致病性的分子基础尚不清楚；尽管如此，细胞因子免疫反应加剧和细胞凋亡导致的B细胞耗竭被认为是导致疾病严重程度的主要因素。在这里，我们研究了I型干扰素（IFN）在IBDV感染中的作用。虽然干扰素预处理可以防止随后的IBDV感染，但在感染后早期将干扰素添加到受感染的细胞培养物中会导致大量凋亡细胞死亡。下调双链RNA依赖性蛋白激酶（PKR）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或核因子κB（NF-κB）的表达可显著降低凋亡程度，表明它们是IBDV经IFN-α治疗后诱导凋亡反应的关键蛋白。我们的结果表明，IBDV基因组dsRNA是导致细胞凋亡的主要病毒因子。这些发现为IBDV诱导鸡免疫抑制的潜在机制和发病机制提供了新的见解。重要性IBDV感染对全球家禽业构成了重要威胁。感染IBDV的鸡会出现严重的免疫抑制，这使得它们极易受到继发感染，并且对其他病原体的疫苗接种无反应。IBDV感染导致的先天性免疫反应早期失调和B细胞凋亡加剧被认为是病毒诱导免疫发病的主要因素。我们的工作首次有助于阐明在暴露于I型干扰素后IBDV感染细胞凋亡死亡的潜在机制。我们提供了关于PKR、TNF-α和NF-κB在这一现象中的关键重要性的确凿证据。上述机制可以促进感染细胞的早期清除，从而帮助改善IBDV诱导的发病机制，但也可能导致B细胞耗竭和免疫抑制。宿主和感染病毒株的遗传背景可能会显著影响这两种对立效应之间的平衡。

关键词：细胞凋亡；传染性法氏囊病病毒；干扰素；发病机制。

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数字

图1
图1
IBDV对干扰素在HeLa细胞中的抗病毒作用敏感。用不同剂量的hIFN-α（0、1、10、100和1000 IU/ml）对HeLa细胞进行预处理，如图所示，在感染IBDV的两个MOI（0.05或2 PFU/cell）前16 h，培养基和感染细胞均于24 h p.i.收获。（A）用VP3抗体对总细胞提取物进行Western blot分析。检测同一细胞提取物中的β-肌动蛋白用于蛋白质负荷控制。（B） 细胞外病毒产生。用感染细胞的上清液通过菌斑试验进行病毒滴定。条纹条，干扰素未处理细胞；固体棒，用干扰素预处理的感染细胞样本。条形图表示基于两个独立实验的重复样品的平均值±标准偏差。*表示P（P）值<0.05，由未配对的学生确定t吨测试。
图2
图2
IFN治疗触发IBDV感染的HeLa细胞的凋亡。如图所示，模拟感染或感染IBDV的HeLa细胞（MOI of 2）在3、6、9或12 h p.i.（分别在文本M+3、M+6、M+9和M+12和i+3、i+6、i+9和i+12中命名的样品）用hIFN-α（1000 IU/ml）治疗，或保持未治疗（−）（分别在文字M和i中命名）。在24小时p.i.通过使用不同的分析对细胞进行分析。（A） 相控显微镜。（B） 用活细胞/死细胞成像试剂孵育后的荧光显微镜，以区分活细胞（绿色）和死细胞（红色）。（C） 模拟感染或感染IBDV并在指定时间用hIFN-α处理的细胞的蛋白质印迹分析，用不同的抗体：抗PARP、抗总PKR（t-PKR）、抗磷酸化（Thr446）PKR（p-PKR）、抗总eIF2α（t-eIF2α）、抗磷酸化（Ser52）eIF2α（p-eIF2α）、抗Mx、抗ISG-56和抗VP3。PARP裂解产物表示为c-PARP。β-肌动蛋白抗体用于蛋白质负荷控制。（D） 使用Caspase-Glo 3/7分析试剂盒从重复样品中测量细胞凋亡，每次测定重复进行。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值被归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于两个独立实验的重复样品的平均值±标准偏差。条纹条，未经干扰素处理的感染细胞样本；固体棒，用干扰素处理的感染细胞样本。（E） 干扰素对半胱天冬酶3/7活性的剂量反应效应分析。用增加剂量（10倍）的hIFN-α（从1到10）治疗小鼠感染或感染的细胞5IU/ml），并使用Caspase-Glo 3/7分析试剂盒在24 h p.i.测定细胞凋亡。（F） IBDV感染的HeLa细胞经干扰素（1000 IU/ml）处理后3 h p.i.和未感染的细胞经不同剂量的staurosporine（STS）（0.5、1和2μM）处理后，分别于处理后24 h收集细胞凋亡水平的比较分析。*和**表示P（P）值分别为<0.05和<0.01，由未配对学生的t吨测试。
图3
图3
干扰素对IBDV感染的HeLa细胞凋亡的触发依赖于PKR的表达。如图所示，模拟感染或感染IBDV的HeLa细胞（MOI of 2）在第3、6、9或12 h p.i.用1000 IU/ml hIFN-α治疗（在整个文本中分别命名为M+3、M+6、M+9和M+12以及i+3、i+6、i+9和i+12的样品），或保持未治疗（−）（在整个文中分别命名M和i），和细胞在24小时后进行分析。（A）用不同抗体对总细胞提取物进行Western blot分析：抗PARP、抗-PKR、抗磷酸化（Thr446）PKR、抗-eIF2α、抗-磷酸化（Ser52）eIF2 A、抗-Mx和抗-VP3。β-肌动蛋白抗体用于蛋白质负荷控制。PARP裂解产物表示为c-PARP。（B） 使用Caspase-Glo 3/7分析试剂盒测量重复样品的细胞凋亡，每次测定重复进行。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值被归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于两个独立实验的重复样品的平均值±标准偏差。条纹条，未经干扰素处理的感染细胞样本；固体棒，用干扰素处理的感染细胞样本。*和**表示P（P）由未配对学生的t吨测试。
图4
图4
IFN治疗后IBDV感染的HeLa细胞中IFN-β和TNF-α基因表达的上调依赖于PKR的表达。用IBDV（MOI为2）感染HeLa对照和HeLa PKR沉默的细胞，并在每天3小时用1000IU/ml的hIFN-α处理或不处理。在每天24小时收获经模拟感染（M和M+3）和IBDV感染（i和i+3）的细胞，并进行RNA提取。如图所示，所选基因的表达水平由SYBR绿色RT-qPCR测定。将每个细胞靶基因的表达水平归一化为HPRT mRNA含量，并显示在日志上10在模拟感染的HeLa沉默对照细胞或HeLa PKR沉默细胞中，随着折叠程度的变化而缩放。条形图表示基于三份样品数据的平均值±标准偏差。虚线条，用IFN处理的模拟感染细胞样本；条纹条，未经干扰素处理的感染细胞样本；实心棒，用干扰素处理的感染细胞样本。*，**，和***表示P（P）由未配对学生确定的值分别为<0.05、<0.01和<0.001t吨测试。ns，不显著。
图5
图5
TNF-α敲低对IFN诱导IBDV感染HeLa细胞凋亡的影响。（A和B）shRNAs沉默TNF-α。用表达无关序列（shC）或靶向TNF-αmRNA（sh1-sh5）的shRNAs的慢病毒载体转导HeLa细胞。在第4天和第12天，用poly（I·C）转染细胞16h，诱导TNF-α基因表达，并用SYBR绿色RT-qPCR检测TNF-βmRNA水平。根据HPRT mRNA水平标准化的TNF-α基因表达水平的结果显示为相对于转染poly（I·C）的HeLa shC细胞水平的倍数变化。条形图表示基于三份样品数据的平均值±标准偏差。*表示P（P）<0.05的值，由未配对学生的t吨测试。（C和D）TNF-α沉默对细胞凋亡的影响。用表达shC、sh1和sh4的慢病毒载体转导的HeLa细胞在12天p.t.的MOI为2时模拟感染或感染IBDV，并在p.i.的3小时用1000 IU/ml hIFN-α处理（+）或不处理（-）。在p.i.24小时收获细胞。（C）使用Caspase-Glo 3/7检测试剂盒测定细胞凋亡。每次测定均一式两份。所提供的数据对应于两个独立实验结果的平均值±标准偏差。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于重复样品数据的平均值±标准偏差。*和**表示P（P）值分别为<0.05和<0.01，由未配对学生的t吨测试。（D） 通过Western blotting分析PARP裂解。将总细胞提取物进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素中，并用血清抗PARP进行免疫印迹。PARP裂解产物表示为c-PARP。采用与β-肌动蛋白相对应的Western blot作为蛋白质负荷对照。
图6
图6
IFN处理的IBDV感染细胞中细胞凋亡的触发与PKR磷酸化和IFN-β基因表达的上调相关。模拟感染（M）或感染IBDV（MOI of 2）（I）的HeLa细胞分别接受或不接受hIFN-α（每次3 h时1000 IU/ml）（分别为M+3和I+3）的治疗，并在指定的p.I.（A）用抗PARP、抗-PKR、抗p-PKR和抗VP3抗体对总细胞提取物进行Western blot分析。采用与β-肌动蛋白相对应的Western blot作为蛋白质负荷对照。PARP裂解产物表示为c-PARP。（B） 实时定量细胞死亡分析。如上所述处理的Mock感染和IBDV感染的HeLa细胞用如材料和方法中所述的IncuCyte胱天蛋白酶3/7凋亡测定试剂孵育，并且在感染后24小时内用IncuCyte Zoom系统设备监测细胞培养。使用IncuCyte Zoom软件分析在每个实验条件下重复培养中的凋亡细胞死亡，通过绿色细胞的外观进行可视化。用hIFN-α处理的细胞感染期间IFN-β（C）和病毒（D和E）RNA的（C到E）RT-qPCR分析。在E组中，在病毒吸附后用7DMA（0.2 mM）处理或不处理细胞，然后在3 h p.I.用hIFN-α处理（I+3）（实心条）或不处理（I）（条纹条）。如图所示，所选基因的表达水平由SYBR绿色RT-qPCR测定。IFN-β靶基因的表达水平根据HPRT mRNA含量进行了标准化，并在日志上显示10在模拟感染的HeLa细胞中，作为水平的倍数变化。（F） 使用Caspase-Glo 3/7检测试剂盒，在24 h p.I.测定经7DMA（0.2 mM）处理或未处理的M、M+3、I和I+3细胞样本中病毒吸附后的细胞凋亡。每次测定均一式两份。所提供的数据对应于两个独立实验结果的平均值±标准偏差。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于重复样品数据的平均值±标准偏差。*和**表示P（P）值分别为<0.05和<0.01，由未配对学生的t吨测试。
图7
图7
IBDV感染的HeLa细胞经干扰素处理后NF-κB活化。用hIFN-α（每次3小时1000 IU/ml）（分别为M+3和I+3）处理或不处理模拟感染IBDV（MOI为2）的HeLa细胞（M）或感染IBDV-（I为2的MOI）的细胞，并分析NF-κB p65亚基的核转位。所示为在指定时间p.i.采集的细胞的核和细胞溶质部分中p65的Western blot分析。每个部分都经过SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素中，并用血清抗p65免疫印迹。与组蛋白H2B和α-微管蛋白相对应的蛋白质印迹分别用作核组分和细胞溶质组分的蛋白质负荷对照。
图8
图8
蛋白酶体抑制剂MG132或NF-κB特异性抑制剂对p65核转位的抑制显著影响IFN对IBDV感染细胞凋亡的触发。用蛋白酶体抑制剂MG132（2μM）或DMSO（用作对照）吸附病毒后，立即处理模拟感染或感染IBDV（MOI为2）的HeLa细胞，并在每次3h（分别为M+3和I+3）用hIFN-α（1000 IU/ml）孵育。在指定时间p.i.（A）对细胞核和细胞溶质部分的p65进行Western blot分析，采集细胞样本。样品进行亚细胞分离，每个组分进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素中，并用血清抗p65抗体进行免疫印迹。与组蛋白H2B和α-微管蛋白相对应的蛋白质印迹分别用作核组分和细胞溶质组分的蛋白质负荷对照。M、 未经处理的模拟感染细胞分数。（B） 使用Caspase-Glo 3/7分析试剂盒测量在指定时间p.i.采集的细胞样本中的凋亡细胞死亡。每次测定均一式两份。所提供的数据对应于两个独立实验结果的平均值±标准偏差。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于重复样本数据的平均值±标准偏差。（C） 通过Western blotting分析用NF-κB特异性抑制剂处理的细胞中TNF-α处理后p65移位。用IKKβ特异性抑制剂SC-514、p65易位抑制剂JSH-23（分别为50和25μM）或DMSO作为对照（−）处理HeLa细胞2小时，然后用TNF-α（20 ng/ml）处理30分钟。用抗p65和IκBα的抗体分析细胞核和细胞溶质部分。组蛋白H2B和α-微管蛋白分别用作核组分和细胞溶质组分的蛋白质负荷控制。（D） 通过Western blotting分析用NF-κB特异性抑制剂处理IFN处理的IBDV感染细胞中的p65移位。感染IBDV的HeLa细胞在第3小时用IFN处理（i+3），在第14小时用SC-514、JSH-23（分别为50和25μM）或DMSO作为对照（−）。在指定时间收集细胞样本。通过使用抗p65、iκBα和VP3的抗体分析细胞核和胞浆部分。组蛋白H2B和α-微管蛋白用作蛋白质负荷对照。（E） 如上文所述，以SC-514、JSH-23（分别为50和25μM）或二甲基亚砜（DMSO）作为对照处理的M、M+3、I和I+3细胞样本在14h p.I.时的凋亡细胞死亡在24h p.I.时进行了测量。*和**表明P（P）值分别为<0.05和<0.01，由未配对学生的t吨测试。
图9
图9
干扰素治疗后，在转染IBDV基因组RNA的细胞中触发凋亡，但在与IBDV-VLPs孵育的细胞中没有。HeLa细胞或模拟感染（M）、感染（I）IBDV（MOI为2）、用IBDV衍生VLP（V）孵育或转染基因组dsRNA（R），在3 h p.I.（分别为M+3、I+3、V+3和R+3）用或不用hIFN-α（1000 IU/ml）处理。于24h p.i.采集细胞，并使用Caspase-Glo 3/7检测试剂盒测量凋亡细胞死亡。每次测定均一式两份。所提供的数据对应于两个独立实验结果的平均值±标准偏差。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为相应模拟感染细胞的值。条形图表示基于重复样品数据的平均值±标准偏差。*和**表示P（P）由未配对学生的t吨测试。ns，不显著。
图10
图10
干扰素治疗可诱导感染不同IBDV株的HeLa细胞凋亡。模拟感染或感染不同IBDV株（MOI of 2）、Soroa、P2或Bursine的HeLa细胞，如图所示，在3 h p.i.（分别为M+3和i+3）用1000 IU/ml hIFN-α处理，或保持未处理（分别为M和i）。在24 h p.i.时对细胞进行分析。（A）Western blot分析模拟感染或感染不同IBDV株的细胞，并用抗PARP和VP3抗体处理hIFN-α。PARP裂解产物表示为c-PARP。β-肌动蛋白抗体用于蛋白质负荷控制。（B） 使用Caspase-Glo 3/7分析试剂盒从重复样品中测量细胞凋亡，每次测定重复进行。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于两个独立实验的重复样品数据的平均值±标准偏差。黄色条表示模拟感染细胞样本未经干扰素处理（M）和处理（M+3）。*表示P（P）<0.05的值，由未配对学生的t吨测试。
图11
图11
干扰素处理可诱导IBDV感染的鸡DF-1细胞凋亡。DF-1细胞感染IBDV（MOI为2），并在第3小时用1000 U/ml的chIFN-α处理或不处理。在第16小时分析受感染的小鼠（M和M+3）和受IBDV感染的细胞（i和i+3）。凋亡细胞呈绿色。（B） 细胞凋亡测量。作为细胞凋亡的对照，用不同剂量的staurosporine（0.5、1和2μM）处理未感染的DF-1细胞16 h。使用Caspase-Glo 3/7检测试剂盒测量两份样品中的细胞凋亡，每次检测重复进行。感染细胞样本的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶值归一化为模拟感染细胞的值。条形图表示基于来自两个独立实验的重复样品的数据的平均值±标准偏差。**表示P（P）值<0.01，由未配对学生的t吨测试。
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