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.2018年3月13日；8(1):4407.
doi:10.1038/s41598-018-22729-4。

洗涤剂纯化人mGlu的直接偶联5异三聚体G蛋白受体Gq和Gs

查迪·纳斯鲁拉 1, 卡琳·罗蒂尔 1, 罗曼·马塞林 1, 文森特·Compan 1, Joan字体 2, Amadeu Llebaria公司 2, Jean-Philippe别针 1, Jean-Louis Banères 3, 纪尧姆·勒本 4
附属公司

洗涤剂纯化人mGlu的直接偶联5异三聚体G蛋白受体Gq和Gs

查迪·纳斯鲁拉等。 科学代表. .

摘要

代谢型谷氨酸（mGlu）受体是C类G蛋白偶联受体（GPCR），调节哺乳动物大脑的突触活动和可塑性。信号转导是通过谷氨酸与捕蝇草结构域（VFT）的结合启动的，VFT启动了一种构象变化，并传递到保守的七叶结构域（7TM），最终导致细胞内G蛋白的激活。而mGlu1和mGlu5激活Gαq个G蛋白，它们还通过未知机制增加细胞内cAMP浓度。直接研究人mGlu的G蛋白偶联特性5受体同型二聚体，我们纯化了全长受体，需要仔细优化表达、N-糖基化和纯化。我们成功纯化了功能性mGlu5激活异源三聚体G蛋白Gq。高亲和力激动剂PAM VU0424465也在没有立体激动剂的情况下激活了纯化的受体。此外，还发现纯化的mGlu5在用VU0424465或谷氨酸刺激时能够激活G蛋白Gs，尽管后者诱导的反应要弱得多。我们的发现为mGlu提供了重要的机制性见解5G蛋白依赖性活性和选择性。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
功能性C端截短SNAP-mGlu5受体二聚体。(A类)人类mGlu的三维模型5受体在Ala856残基后截断。截短受体由有效G蛋白信号传递所需的所有片段组成，包括维纳斯捕蝇草结构域（VFT）、富含半胱氨酸结构域（CRD）和七螺旋跨膜结构域（7TM）。红色和绿色球体分别代表正构和变构结合位点。(B类)瞬时转染SNAP-Tag全长人mGlu的HEK293细胞中谷氨酸和喹喹酯诱导的IP1生成5受体（黑色和灰色曲线）或SNAP-Tag C端mGlu5-Δ856受体（红色和橙色曲线）。(C类)全长野生型mGlu的热稳定性5和mGlu5-Δ856 [3H] -MPEP结合受体。两种分析的数据点代表平均值 ± 三个独立实验的SEM。
图2
图2
SNAP-mGlu的特性5-∆856 N-糖基化在HEK293细胞中的分布。(A类)五mGlu5N-连接的糖基化位点在VFT（代码pdb 3LMK）的卡通结构（灰色）上突出显示为表面球体（红色）和糖部分（绿色）。与VFT结合的谷氨酸分子中的原子表示为蓝色球体。(B类)单体SNAP-mGlu的SDS-PAGE凝胶迁移5-Δ856和不同的N-糖基化突变体。样品用还原剂（DTT）处理。(C类)荧光标记SNAP-mGlu的细胞表面表达5-Δ856和使用SNAP-Lumi4Tb的不同N-糖基化突变体。凝胶是一个重复至少两次的实验的代表。表达谱是至少三个独立实验的代表。邓内特的测试是其中的一部分-方差分析用于与hmGlu比较的方法5-Δ856设为参考水平。
图3
图3
mGlu的洗涤剂溶解性和热稳定性5-Δ856[3H] -昆虫细胞中的MPEP结合受体。(A类)未净化mGlu的定量5-Δ856受体在4时溶解 °C使用[3H] -在一系列麦芽糖苷基洗涤剂中测定MPEP结合分析，这些洗涤剂包括月桂基麦芽糖新戊二醇-3（MNG3）、n-十二烷基-β-D-麦芽糖甙（DDM）和添加不同比例胆固醇半琥珀酸盐（CHS）的n-癸基-β-D麦芽糖肽（DM）。(B类)mGlu的热稳定性5-Δ856 [3H] -MPEP结合受体在四种不同条件下溶解；DDM（0.83%）、DDM-CHS（0.83–0.083%）、MNG3（0.83%。两种分析的数据点(A、 B类)代表平均值 ± 三个独立实验的SEM。邓内特的测试是其中的一部分-使用方差分析法与MNG3-CHS（0.83–0）和DDM-CHS（0.83–0）进行比较，分别设置为补充CHS的MNG3和DDM的参考水平。
图4
图4
二聚体mGlu的纯化5-在SF9细胞中产生∆856。(A类)人类二聚体mGlu的卡通表示5带有融合蛋白eGFP（绿色）的受体（浅蓝色）取代856位的c末端结构域。(B类)未净化mGlu的定量5受体使用[3H] -MPEP结合分析，测定mGlu5-Δ856，mGlu5-Δ856-eGFP和mGlu5-Δ856-eGFP（N1-N5）。邓内特的测试是其中的一部分-方差分析用于与mGlu比较的方法5-Δ856设为参考水平。(C类)两种结构物的尺寸排除色谱图，mGlu5-Δ856（Ve = 14.5 mL）和mGlu5-Δ856-eGFP（Ve = 14.2 mL）使用叠加6增加。(D类)考马斯蓝染色的mGlu SDS-PAGE凝胶5-Δ856和mGlu5-Δ856 eGFP。所示凝胶是三个独立实验的代表。
图5
图5
谷氨酸和VU0424465触发mGlu5-依赖性Gs和Gq激活。(A类)通过配体活化诱导洗涤剂纯化受体进行GTPγS荧光结合实验。荧光基线是根据不含任何配体的受体单独估算的。数据点表示使用SEM进行的三次独立测量的平均值-方差分析法用于和载脂蛋白条件集作为参考水平进行比较。(B类)微克葡萄糖5-使用IP单细胞检测试剂盒（Cisbio）在HEK293细胞和存在VU0424465和pEC的情况下测量依赖性Gq激活50第页，共8.53页 ± 0.13（n = 4). (C类)微克葡萄糖5-使用cAMP细胞检测试剂盒（Cisbio）分别在HEK293细胞和谷氨酸和VU0424465存在下测量依赖性Gs活化。剂量-反应曲线显示VU0424465在截断mGlu处的正反应5-Δ856（浅绿色，pEC50第页，共8.17页 ± 0.11; n个 = 4） 和WT人mGlu5（深绿色，pEC50第7.80页 ± 0.50; n个 = 3） 曲线。在截断的mGlu处观察到谷氨酸的激活较弱5-Δ856（橙色，pEC50第3.86页 ± 0.20; n个 = 3） 和WT人mGlu5（红色，pEC50第3.36页 ± 0.72; n个 = 3） 曲线。数据点表示至少三个独立的SEM实验中三次测量的平均值。
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