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.2018年12月31日；9(1):783-803.
doi:10.1080/21505594.2018.1449507。

Importinα5负调控Importinβ1介导的新城疫病毒基质蛋白的核导入及病毒在鸡成纤维细胞中的复制和致病性

段志强 1 2, 徐海旭 3, 辛勤集 1 2, 赵家福 1 2, 徐厚强 1 2, 颜虎 2, 姗姗·登 2, 胡顺林 3, 刘秀凡 3
附属公司

导入蛋白α5负调控导入蛋白β1介导的新城疫病毒基质蛋白核导入以及病毒在鸡成纤维细胞中的复制和致病性

段志强等。 毒力. .

摘要

新城疫病毒（NDV）的基质（M）蛋白通过固有核定位信号（NLS）定位于细胞核，但参与NDV M蛋白核输入的细胞蛋白以及M的核定位在NDV复制和致病性中的作用尚不清楚。在本研究中，通过酵母双杂交筛选importinβ1与NDV M蛋白相互作用。这种相互作用随后通过联合免疫沉淀和下拉试验得到证实。体外结合研究表明，M蛋白的NLS区和属于RanGTP结合区的importinβ1的氨基酸336-433对结合很重要。重要的是，一种带有M/NLS突变的重组病毒导致NDV的病理类型改变，并减弱了病毒在鸡成纤维细胞和SPF鸡中的复制和致病性。与结合数据一致，NDV M蛋白在洋地黄素透性HeLa细胞中的核导入需要importinβ1和RanGTP。有趣的是，importinα5被证实通过结合importinβ1与M蛋白相互作用。然而，siRNA去除importinβ1或importinα5可导致不同的结果，这表明M蛋白在鸡成纤维细胞中有明显的细胞质或细胞核积累，NDV的复制能力和致病性分别显著降低或增加。因此，我们的研究结果首次证明了NDV M蛋白的核导入机制以及导入蛋白α5在导入蛋白β1介导的M蛋白核导入中的负调控作用，以及副粘病毒的复制和致病性。

关键词：新城疫病毒；鸡成纤维细胞；基质蛋白；核进口机制；核定位信号。

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数字

图1。
图1。
通过酵母双杂交试验筛选与NDV M蛋白相互作用的细胞蛋白。（A） 将诱饵质粒pGBKT7-M转化的AH109与含有pGADT7-Rec的酵母Y187与DF-1细胞的cDNA文库进行交配。在营养缺陷培养基SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上筛选疑似阳性菌落。1号为阴性对照，2号为阳性对照。（B） 从（A）中获得的酵母菌落在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上培养。培养基上生长的菌落变蓝表明这两种表达的蛋白质相互作用。（C） 将从（A）中获得的酵母菌落转移到硝化纤维过滤器中，并检测β-半乳糖苷酶活性，以验证NDV M蛋白与细胞蛋白之间的相互作用。
图2。
图2。
NDV M蛋白与importinβ1相互作用体内和在体外（A）DF-1细胞中Myc-importinβ1和NDV M蛋白的交互免疫沉淀分析。转染表达Myc-importinβ1质粒的DF-1细胞感染NDV，MOI为0.1。在感染后24小时对细胞进行裂解，并使用抗Myc（中面板）或抗M（下面板）抗体进行联合免疫沉淀分析。使用抗M或抗Myc抗体通过Western blotting检测免疫沉淀蛋白。（B） GST下拉试验验证了M与importinβ1之间的相互作用。GST或GST-M或His-importinβ1蛋白在大肠杆菌BL21（DE3），并分别用谷胱甘肽Sepharose珠或His*Bind树脂纯化。将纯化的GST或GST-M蛋白（3μg）固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，然后在4°C下与纯化的His-importinβ1（3μg）孵育2 h。用运输缓冲液清洗珠子，从珠子中洗脱结合蛋白并用Western blotting检测。（C和D）GST-M/NLSm或His-importinβ1(△336-433）表达于大肠杆菌BL21（DE3），然后如上所述进行纯化。进行GST下拉和His下拉分析，以确定M和importinβ1之间的相互作用域。
图3。
图3。
M/NLS突变降低了NDV在细胞内的复制能力。（A） 免疫荧光法检测NDV M蛋白在rSS1GFP和rSS1GWP-M/NLSm感染的DF-1细胞中的亚细胞定位。DAPI用于细胞核染色。原始放大倍数为1×200。（B） 由rSS1GFP和rSS1GWP-M/NLSm在DF-1细胞中形成的斑块的形状和大小。用连续十倍稀释的病毒感染六孔板中的DF-1细胞1h。吸附后，去除接种物并用含有2%FBS和1%琼脂的培养基替换。培养36小时后，添加添加0.1%中性红的覆盖培养基。再培养48小时后观察到斑块。（C） 在指定的时间点测定DF-1细胞中的病毒滴度。曲线上的每个数据点表示三个独立实验的平均值±SD。P值<0.001用***表示，P值<0.01用**表示。（D） 在指定的时间点，在病毒感染的DF-1细胞中观察到CPE。图像是使用相控显微镜获得的。原始放大倍数为1×200。
图4。
图4。
M/NLS突变可减弱NDV在鸡体内的复制和致病性。（A） 4周龄SPF鸡的存活曲线（每组10只）。鸟类接种rSS1GFP或rSS1GWP-M/NLSm，剂量为105EID公司50/每只鸟100μL，或以100μL PBS作为阴性对照。每天监测这些鸟的临床症状，每次10 dpi。（B） 在5 dpi下感染这两种病毒的4周龄鸡（n=3）的收集组织中的病毒载量。在DF-1细胞中测定病毒滴度，并以对数表示10TCID公司50克−1组织。星号表示这两种病毒的滴度在统计学上存在显著差异。P值<0.001用***表示。（C） 从接种rSS1GFP或rSS1GWP-M/NLSm或PBS的4周龄鸡中采集的淋巴组织样本的组织病理学。在5dpi时处死鸟类，用10%中性福尔马林固定组织，切片并用苏木精-伊红染色。
图5。
图5。
NDV M蛋白的核导入需要importinβ1和RanGTP。（A） 分别用质粒pEGFP-M和编码DsRed-DN-importinα5、DsRed-Nimportinβ1、DsRed-M9M、DsRed-Bimax2、DsRed-RanQ69L或DsRed/NTF2/E42K的质粒瞬时共转染DF-1细胞。转染后24小时，在荧光显微镜下观察融合蛋白的亚细胞定位。DAPI染色细胞核。原始放大倍数为1×200。（B） Western blotting检测（A）融合蛋白EGFP-M的细胞内分布。细胞核的层粘连蛋白B1和细胞质的微管蛋白被用作细胞标记。N代表细胞核，C代表细胞质。（C） 用GST-M-GFP在细胞液、importinβ1、RanGTP、RanGDP、importionβ1+RanGTP，importin？+RanGDP或importin。DAPI染色细胞核。荧光显微镜下观察GST-M-GFP蛋白。原始放大倍数为1×200。
图6。
图6。
伊维菌素不抑制M蛋白的核导入和NDV的复制。（A） 用伊维菌素或二甲基亚砜在12 hpi处理病毒感染的DF-1细胞中NDV M蛋白的亚细胞定位。DAPI染色细胞核。原始放大倍数为1×200。（B） Western blotting检测从（A）中获得的NDV M蛋白在细胞内的分布。细胞核的层粘连蛋白B1和细胞质的微管蛋白被用作细胞标记。N代表细胞核，C代表细胞质。（C） 在相控显微镜下观察用伊维菌素或二甲基亚砜在12 hpi处理的病毒感染的DF-1细胞中的CPE。原始放大倍数为1×200。（D） 荧光显微镜下观察GFP在病毒感染的DF-1细胞中的表达，并用Western blotting检测GFP的表达。（E） 用药物伊维菌素或二甲基亚砜处理DF-1细胞，然后以0.1的MOI感染rSS1GFP。在12和24 hpi时收集细胞培养上清液，并测定病毒滴度为TCID50在DF-1细胞中。
图7。
图7。
Importinα5通过与Importinβ1相互作用结合NDV M蛋白。（A） 融合蛋白在DF-1细胞中的亚细胞定位。将所示质粒转染到DF-1细胞中，然后在转染后24小时用于免疫荧光分析。DAPI染色细胞核。在尼康荧光显微镜下获得荧光图像。原始放大倍数为1×200。（B） 通过相互免疫共沉淀法表征NDV M蛋白和细胞转运蛋白之间的相互作用。在转染后24小时裂解用质粒转染的DF-1细胞，并使用抗HA（上图）或抗Myc（下图）抗体进行共免疫沉淀测定。使用抗Myc或抗HA抗体通过Western blotting检测免疫沉淀蛋白。（C） 通过下拉分析鉴定进口蛋白α5和M或进口蛋白β1之间的相互作用。纯化的GST-M或GST-importinβ1蛋白固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，然后与纯化的His-importinα5孵育。结合蛋白从珠子中洗脱出来，并通过Western blotting进行检测。（D） 采用蛋白质结合分析鉴定M、importinα5和importinβ1之间的相互作用。第1车道仅为GST-M，第2车道为GST-M+His-importinα5，第3车道为GST-M+His-importinβ1，第4车道为GSM-M+His-importinβ5+His-importinβ1。
图8。
图8。
Importinα5减少NDV M蛋白的Importinβ1介导的核导入。（A和B）importinβ1或importinα5 RNAi分别对内源性importin。用importinβ1或importinα5 siRNA（#1-3）或对照siRNA转染DF-1细胞。转染48 h后，制备细胞裂解物并用抗importin？或抗importion？抗体进行Western blot检测。内源性GAPDH表达作为内部对照。（C） 用importinβ1 siRNA或importinα5 siRNA或对照siRNA转染DF-1细胞。转染后48小时，细胞以1。NDV M蛋白在感染病毒的DF-1细胞中的亚细胞定位分别在6 hpi和12 hpi下检测。DAPI染色细胞核。原始放大倍数为1×200。（D） 免疫印迹分析M在导入蛋白β1 siRNA或导入蛋白α5 siRNA或对照siRNA处理的DF-1细胞中的细胞内分布。N代表细胞核，C代表细胞质。
图9。
图9。
Importinα5降低Importinβ1参与的NDV复制和致病性。（A） 正常细胞、RNAi控制细胞、导入素β1-RNAi细胞和导入素α5-RNAi单元格在MOI为1时感染rSS1GFP。感染后24小时，在相控显微镜下观察CPE。（B） 荧光显微镜下观察（A）中GFP的表达，并用Western blotting检测。（C和D）正常细胞、RNAi控制细胞、importinβ1-RNAi细胞和importinα5-RNAi细胞在MOI为1时感染rSS1GFP。在不同的时间点（6、12、24、48和72 hpi），用TCID测定细胞培养上清（C）和细胞颗粒（D）中的病毒载量50在DF-1细胞中。图表显示了三个独立实验中DF-1细胞中病毒滴度的平均值。（E和F）qRT-PCR分别用于检测感染后24 h细胞培养上清（E）和（C）和（D）细胞颗粒（F）中NDV M基因的mRNA表达水平。这些图表显示了三个独立实验中DF-1细胞中NDV M基因mRNA水平的平均值。P值<0.001用***表示，P值<0.01用**表示。
图10。
图10。
importinα5在importinβ1介导的M蛋白核导入中的负调控作用以及NDV的复制和致病性的示意图。
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本项目得到了国家自然科学基金（No.31502074和31760732）、贵州省科学技术基金（No.QKH-2015-254）、贵州农业科研项目（No.QKHZC-2016-2588）、中国公益性农业科学研究专项基金（No.201303033）的资助贵州大学人才基金科研项目（编号：GDRJHZ-2014-10）。