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.2018年5月;109(5):1627-1637.
doi:10.1111/cas.13570。 Epub 2018年4月15日。

辛伐他汀激活AMPK通过抑制HIF-1α诱导的促血管生成因子抑制乳腺癌血管生成

附属公司

辛伐他汀激活AMPK通过抑制HIF-1α诱导的促血管生成因子抑制乳腺癌血管生成

王继昌等。 癌症科学. 2018年5月.

摘要

临床前研究的大量数据揭示了他汀类药物对心血管血管生成的双相作用。尽管一些人报道了他汀类药物在恶性肿瘤中的抗血管生成潜力,但其潜在机制仍不清楚。本研究的目的是阐明抑制素家族成员辛伐他汀抑制肿瘤血管生成的机制。辛伐他汀在体外显著抑制肿瘤细胞条件培养基诱导的血管生成促进作用,并在体内产生剂量依赖性的抗血管生成作用。进一步基因沉默低氧诱导因子-1α(HIF-1α)可降低4T1细胞中血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子-2的表达,并相应改善肿瘤细胞条件培养液促进的HUVEC增殖。此外,辛伐他汀通过增加AMP激酶的磷酸化水平,通过转录后下调HIF-1α的机制诱导血管生成抑制。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸降低HIF-1α蛋白水平,改善内皮细胞在体内外的血管生成能力,进一步证实了这些结果。关键的是,化合物C对AMPK磷酸化的抑制几乎完全消除了辛伐他汀诱导的抗血管生成作用,同时伴有HIF-1α及其下游促血管生成因子蛋白水平的降低。这些发现揭示了辛伐他汀诱导肿瘤抗血管生成的机制,从而确定了他汀类药物对恶性肿瘤有益作用的靶点。

关键词:AMPK;HIF-1α;抗血管生成;辛伐他汀;他汀类药物。

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图1
图1
辛伐他汀通过旁分泌相关机制抑制肿瘤血管生成。A、 对辛伐他汀治疗组和对照组小鼠的4T1肿瘤进行双重免疫染色光盘31(绿色)和α-平滑肌肌动蛋白(α-座椅模块组件)(红色)和B,定量微血管密度和周细胞覆盖的血管(n=8)。白色箭头表示维管芽;黄色箭头表示血管周细胞。比例尺=100μm。C、 的缩微照片TRITC公司凝集素灌注和光盘对照组和辛伐他汀治疗的4T1肿瘤中31条染色血管。TRITC公司‐在小鼠被杀死前15分钟,将凝集素注射到小鼠的尾静脉中。比例尺=100μm。D、 凝集素灌注的定量光盘31+容器(总百分比光盘31+血管)。E、 显示未经治疗或辛伐他汀治疗的小鼠4T1肿瘤体内生长曲线的代表性图像(SMV公司)(n=8)。F、 G、,SMV公司预处理(0.5μmol/L)降低了HUVEC公司s、 4T1肿瘤细胞(n=6)的肿瘤细胞条件培养基促进了其表达。HUVEC公司s在无血清培养基中培养(SFM公司)或调节介质(厘米)4T1细胞,未经处理(Con)或用SMV公司H、I、,SMV公司预处理大大抑制了HUVEC公司秒(欧盟委员会)在(H)4T1或(I)中培养丙二醛MB(MB)‐231调节培养基(厘米)(n=6)。定量数据表示为平均值±标准偏差. *P(P)< .05; ***P(P)< .001. ns,无统计学显著差异(P(P)> .05)
图2
图2
抑制缺氧诱导因子-1α(高强度聚焦1α)诱导的促血管生成因子在很大程度上归因于辛伐他汀(SMV公司)诱导的血管生成抑制。A、 蛋白质水平的免疫印迹高强度聚焦未处理或用0.1或0.5μmol/L处理的4T1细胞中的-1αSMV公司持续12小时。GAPDH公司用作蛋白质负荷的控制。B、 用于显示信使核糖核酸的级别高强度聚焦‐1α,血管内皮生长因子(血管内皮生长因子)和成纤维细胞生长因子‐2(FGF公司‐2)未经处理或SMV公司处理过的4T1细胞。用于免疫组织化学(国际控股公司)检测,4T1肿瘤BALB公司/用美国公共广播电视公司(Con)或15 mg/kg/天SMV公司持续14天。国际控股公司检测高强度聚焦‐1α(C),血管内皮生长因子(D) 、和FGF公司‐4T1肿瘤切片中的2(E)。比例尺=100μm。面板(C)中的红色箭头表示高强度聚焦‐1α核+细胞。F、 百分比高强度聚焦‐1α核+单元格(总单元格百分比;左)和量化国际控股公司分数血管内皮生长因子FGF公司‐2个4T1肿瘤(右;n=8)。G、 Western blotting检测血管内皮生长因子FGF公司对照组织和SMV公司治疗的4T1肿瘤。蛋白质表达高强度聚焦‐1α(H),和血管内皮生长因子FGF公司‐2(I)个4T1细胞对SMV公司治疗后高强度聚焦‐1α敲除。J、 细胞活力HUVEC公司s用无血清培养基培养(SFM公司)或4T1调节或丙二醛MB(MB)‐213‐条件培养基(n=6)。4T1和丙二醛MB(MB)‐用si处理231个细胞核糖核酸‐控制(siCtrl)或si核糖核酸高强度聚焦‐1α(si高强度聚焦‐1α)24小时。用美国公共广播电视公司24h后收集条件培养液。定量数据表示为平均值±标准偏差. *P(P)< .05; **P(P)< .01; ***P(P)< .001. ns,无统计学显著差异(P(P)> .05). 控制装置
图3
图3
辛伐他汀(SMV公司)低氧诱导因子-1α减少(高强度聚焦‐1α)蛋白水平放大器激酶(AMPK公司). A、 典型的Western blot分析显示AMPK公司/磷酸化(p‐)AMPK公司4T1肿瘤细胞经美国公共广播电视公司或不同剂量的表面活性剂.B,分泌的血管内皮生长因子的定量(血管内皮生长因子)和成纤维细胞生长因子-2(FGF公司‐2)4T1细胞上清液中的蛋白质酶联免疫吸附试验(n=6)。C、 显示信使核糖核酸的级别高强度聚焦‐1α,血管内皮生长因子,以及FGF公司‐2在未经处理或用1 mmol/L 5-氨基咪唑‐4-甲酰胺核糖核苷酸处理的4T1细胞中(AICAR公司). D、 p‐的免疫印迹AMPK公司/AMPK公司/高强度聚焦‐1α英寸AICAR公司处理或未处理的4T1细胞。GAPDH公司用作蛋白质负荷的控制。免疫组织化学(国际控股公司)检测高强度聚焦‐1α(E),血管内皮生长因子(F) 、和FGF公司‐4T1肿瘤切片中的2(G)。面板(E)中的红色箭头表示高强度聚焦‐1α核+细胞。疤痕条=100μm。H、 百分比高强度聚焦‐1α核+单元格(总单元格百分比;左侧)和国际控股公司量化血管内皮生长因子FGF公司‐在4T1肿瘤治疗的切片中美国公共广播电视公司(浓度)或400 mg/kgAICAR公司(右;n=8)。一、 显示未经治疗或经治疗的小鼠4T1肿瘤生长曲线的代表性图像AICAR公司(n=8)。J、 70S6K和4E总水平和磷酸化水平的免疫印迹英国石油公司‐1,两个直接目标mTOR公司,英寸自动驾驶汽车处理或未处理的4T1细胞。定量数据表示为平均值±标准偏差. *P(P)<0.05**P(P)< .01; ***P(P)< .001. ns,无统计学显著差异(P(P)> .05)
图4
图4
5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR公司),特定放大器激酶激活剂,抑制体内肿瘤血管生成。4T1荷瘤小鼠接受美国公共广播电视公司(对照;Con)或400 mg/kgAICAR公司14天。提取肿瘤组织并制备用于进一步免疫组织化学(国际控股公司)免疫荧光检测。A、 代表国际控股公司分析光盘31+血管4T1原位肿瘤。标尺=100μm。B、 数量的量化光盘31+中的容器AICAR公司美国公共广播电视公司治疗的4T1肿瘤(n=8)。C、 免疫荧光染色显示光盘31+船只。白色箭头表示对照组4T1肿瘤切片中的血管芽。AICAR公司抑制肿瘤血管的萌芽能力。D、 对照或对照4T1肿瘤切片中血管芽的定量(每个血管)AICAR公司治疗组(n=8)。定量数据表示为平均值±标准偏差. **P(P)< .01; ***P(P)< .001. ns,无统计学显著差异(P(P)> .05)
图5
图5
5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR公司)抑制肿瘤细胞条件培养液的促血管生成作用。4T1和丙二醛MB(MB)‐用1 mmol/L预处理231个细胞AICAR公司24小时后,用美国公共广播电视公司,条件培养基(厘米)24小时后收集用于进一步培养HUVEC公司s.A、C、代表性图片HUVEC公司4T1促进的介导管形成厘米(A) 和丙二醛MB(MB)‐231‐厘米(C) ●●●●。B、 D,管长度的量化HUVEC公司响应4T1‐厘米(B) 和丙二醛MB(MB)‐231‐厘米(D) (n=6)。E、 显示细胞活性的代表性图像HUVEC公司用无血清培养基处理(SFM公司)或厘米用预处理过的肿瘤细胞AICAR公司.F,分泌的血管内皮生长因子的定量(血管内皮生长因子)和成纤维细胞生长因子-2(FGF公司‐2)4T1细胞上清液中的蛋白质酶联免疫吸附试验(n=6)。定量数据表示为平均值±标准偏差. *P(P)<0.05**P(P)< .01; ***P(P)< .001. 控制;ns,无统计学显著差异(P(P)> .05)
图6
图6
抑制放大器激酶(AMPK公司)化合物C激活消除辛伐他汀的抑制作用(SMV公司)缺氧诱导因子-1α(高强度聚焦‐1α)诱导肿瘤血管生成。A、 显示免疫组织化学的代表性图像(国际控股公司)分析光盘31+小鼠4T1肿瘤的血管美国公共广播电视公司(对照;对照),15 mg/kgSMV公司或联合治疗15 mg/kgSMV公司和20 mg/kg化合物C(立方厘米). 比例尺=100μm。B、 微血管密度定量(血管数量/mm2)4T1肿瘤中(n=8)。C、 显示未经治疗或经治疗的小鼠4T1肿瘤生长曲线的代表性图像SMV公司或联合治疗表面活性剂立方厘米(n=8)。D‐F,免疫染色的代表性图像高强度聚焦‐1α(D),血管内皮生长因子(血管内皮生长因子)(E)和成纤维细胞生长因子‐2(FGF公司‐2)(F)在对照的4T1肿瘤切片中,SMV公司,或SMV公司立方厘米组合组。面板(D)中的红色箭头表示高强度聚焦‐1α核+细胞。疤痕条=100μm。G、 百分比高强度聚焦‐1α核+单元格(总单元格百分比;左)和量化国际控股公司分数血管内皮生长因子FGF公司‐4T1肿瘤切片中2个(右;n=8)。H、 磷酸化p-AMPK的总免疫印迹AMPK公司,以及高强度聚焦‐用美国公共广播电视公司(对照),0.5μmol/LSMV公司,或0.5μmol/L的组合SMV公司和5μmol/L立方厘米.GAPDH公司用作蛋白质负荷的控制。我,RT公司聚合酶链反应用于确定信使核糖核酸的级别高强度聚焦‐1α,血管内皮生长因子,以及FGF公司‐2个4T1肿瘤细胞。定量数据表示为平均值±标准偏差. *P(P)< .05; **P(P)< .01; ***P(P)< .001. ns,无统计学显著差异(P(P)> .05)
图7
图7
辛伐他汀诱导的抗血管生成示意图。辛伐他汀治疗可增加放大器激酶(AMPK公司)从而抑制促血管生成因子(包括血管内皮生长因子[血管内皮生长因子]和成纤维细胞生长因子‐2[FGF公司‐2])通过减少肿瘤缺氧诱导因子‐1α诱导肿瘤血管生成(高强度聚焦‐1α)蛋白水平。AICAR公司,5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸

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