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.2018年5月1日：377:174-183。
doi:10.1016/j.neuroscience.2018.02.047。 Epub 2018年3月9日。

磷脂酶D2的脂肪酶活性与帕金森病大鼠模型黑质神经变性的关系

赫克托尔·门德斯·戈梅兹 1, 贾斯比尔·辛格 2, 克雷格·迈耶斯 2, 陈伟军 2, 奥列格·S·戈尔巴托克 三, 尼古拉斯·穆齐奇卡（Nicholas Muzyczka） 2
附属公司

磷脂酶D2的脂肪酶活性与帕金森病大鼠模型的黑色素变性有关

赫克托尔·门德斯·戈梅兹等。 神经科学. .

摘要

磷脂酶D2（PLD2）是一种参与囊泡运输和膜信号传递的酶，与α-突触核蛋白相互作用，α-突触核蛋白是一种已知参与帕金森病（PD）发展的蛋白质。我们之前报道过，PLD2在大鼠黑质致密部（SNc）过度表达会导致多巴胺神经元的快速神经变性，α-突触核蛋白抑制PLD2诱导的黑质变性（Gorbatyuk等人，2010年）。在这里，我们报告PLD2的毒性是由于其脂肪酶活性。PLD2催化失活突变体（K758R）的过度表达可防止SNc中多巴胺能神经元的丢失，并且在过度表达10周后未显示毒性迹象。此外，突变体K758R不影响纹状体中的多巴胺水平。相反，阻止PLD2与动力蛋白或生长因子受体结合蛋白2（Grb2）相互作用但保留脂肪酶活性的突变体继续表现出快速的神经变性。这些发现表明，PLD2与动态蛋白（在囊泡运输中起作用）的相互作用，以及PLD2和Grb2的相互作用（在细胞周期控制、趋化性和酪氨酸激酶复合物激活中起多重作用）都不是神经退行性变的主要原因。相反，磷脂酸（PLD2的产物）的合成是PLD2诱导的神经退行性变的关键，它是多种细胞途径中的第二信使。α-突触核蛋白是PLD2活性的调节因子，这一事实表明PLD2活性的调节在PD的进展中可能很重要。

关键词：AAV转基因；PLD2；帕金森病；α-同核蛋白；神经变性；磷脂酰胆碱。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

N.M.是rAAV技术相关专利的发明者，并拥有基因治疗公司的股权，这些公司将AAV商业化用于基因治疗应用。其余的作者声明，他们没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。大鼠PLD2图
PX和PH是参与蛋白质和脂质相互作用的plecstrin和hox结构域。突变Y179F影响PLD2与Grb2的相互作用。突变R180K改变了与Dynamin的相互作用。区域I–IV是酶活性所必需的，包含保守的催化位点HKD和PIP2结合位点。突变K758R产生无脂肪酶活性的PLD2蛋白。
图2
图2。wt-PLD2及其突变体的脂肪酶活性
(A类)用DNA构建物PLD2、Y179F、R180K、K758R或GFP转染HEK293细胞。24小时后，收集细胞，处理细胞提取物，并使用Amplex Red PLD检测试剂盒测定PLD2活性水平。结果以相对荧光单位（RFU）表示，即平均值+SEM（每组5次转染）。Kruskal-Wallis检验p<0.0001；Dunn的多重比较试验表明，与K758R相比，*p<0.05，**=p<0.01，与GFP相比，#p<0.05，##=p<0.01。(B类)将表达wt PLD2、Y179F、R180K、K758R或GFP的AAV载体单侧注入右侧SNc。注射后2周，收集大脑两侧的黑质组织，并测量单个动物注射侧和未注射侧的PLD活性。结果表示为注射侧与未注射侧的PLD活性百分比（PLD活性为100%），为平均值±SEM（每组4–6只动物）。单因素方差分析结果如下：F[4,15]=6.369，p<0.01；土耳其的事后结果显示，*=p<0.05 vs K758R，**=p<0.01 vs K768R，#=p<0.0 vs GFP。
图3
图3。TH数量+wt-PLD2和突变体过度表达后SNc中的神经元
注射含有PLD2、Y179F、R180K、K758R或GFP的AAV后4周大鼠的黑质切片的显微照片，对TH（A-E）、HA（F-I）和GFP（J）进行染色。箭头标记黑质致密部（SNc）。PLD2、Y179F、R180K、K758R蛋白可以用抗HA抗体检测到，因为它们在蛋白的N末端插入了标记HA表位。尼格拉TH的无偏体视学估计+测量SNc的细胞数（K），结果表示为TH的%+注射侧细胞多于未注射侧细胞，平均值±SEM（每组5–6只动物，每只动物一个数据点）。单因素方差分析统计结果为：F[4,21]=17.41，p<0.0001；土耳其的事后结果显示***=p<0.001 vs K758R，###=p<0.00 vs GFP。Vta，腹段面积。SNr，黑质网状部。
图4
图4。wt-PLD2和PLD2突变体过度表达的纹状体TH表达和多巴胺、DOPAC和HVA水平
在含有wt PLD2（A）、Y179F（B）、R180K（D）、K758R（E）或GFP（C）的AAV的SNc中注射4周后，对大鼠纹状体切片进行TH（A–E）染色的显微照片。按照材料和方法中的描述处理纹状体组织提取物，并测量DA、DOPAC和HVA水平（F）。结果表示为注射侧与未注射侧DA、DOPAC和HVA的百分比，为平均值±SEM（每组5只动物）。单因素方差分析统计：DA、DOPAC和HVA的F[4,20]=19.35，p<0.0001；土耳其的事后结果表明***=p<0.001 vs K758R，###=p<0.00 vs GFP。
图5
图5。TH数量+wt-PLD2和突变体长时间过度表达后SNc中的神经元
注射含有wt PLD2、Y179F、R180K、K758R或GFP的AAV后10周大鼠黑质切片的显微照片，对TH（A–E）、HA（F–I）和GFP（J）进行染色。尼格拉TH的无偏体视学估计+测量SNc的细胞数（K），结果表示为TH的%+注射侧细胞多于未注射侧细胞，平均值±SEM（n=4-8只动物/组，每只动物一个数据点）。单因素方差分析统计结果为：F[4,20]=7.31，p=0.0008；与K758R相比，土耳其的事后结果分别为*、**=p<0.05和p<0.01。
图6
图6。wt-PLD2和突变体长期过度表达后纹状体中TH的表达
提取10周龄动物的纹状体组织并汇总，然后用TH抗体进行免疫印迹。使用GAPDH作为负荷控制。结果表示为注射侧TH水平相对于未注射侧的百分比，用GAPDH水平进行标准化，作为平均值±SEM（每组4–8只动物）。单因素方差分析结果如下：F[4,21]=25.75，p<0.0001；土耳其的事后结果表明***=p<0.001 vs.K758R，###=p<0.00 vs.GFP。
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参考文献

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