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.2018年3月8日；9(1):1009.
doi:10.1038/s41467-018-03394-7。

HDAC9-MALAT1-BRG1复合物介导胸主动脉瘤平滑肌功能障碍

克里斯蒂安·利诺·卡德纳斯 1 2 三, 大通·W·凯辛格 2 三, 伊莎·程 1 2 三, 卡罗琳·麦克唐纳 1 2 三, 托马斯·麦克吉利夫雷 1 4, 布莱恩·戈沙伊拉 1 5, 洛伊·胡莱赫尔（Luai Huleihel） 6 7, 赛法尔·努里 1 2 三, 阿什什·S·耶里 三, 法鲁克·贾弗 2 三, 纳夫塔利·卡明斯基 7, 帕特里克·埃利诺 2 三 8, 尼尔·L·温特劳布 9, 拉杰夫·马尔霍特拉 2 三, 埃里克·梅塞尔巴赫 1 2 三, 马克·林赛 10 11 12 13 14
附属公司

HDAC9-MALAT1-BRG1复合物介导胸主动脉瘤平滑肌功能障碍

克里斯蒂安·利诺·卡德纳斯等。 国家公社. .

摘要

胸主动脉瘤（TAA）与影响TGF-β信号通路成员或血管平滑肌细胞（VSMC）肌动球蛋白细胞骨架成分和调节因子的突变有关。虽然这两个临床组表现出相似的表型，但潜在共同发病机制的存在仍不清楚。在此，我们表明，影响TGF-β信号传导和VSMC细胞骨架的突变均导致形成三元复合物，包括组蛋白脱乙酰化酶HDAC9、染色质重塑酶BRG1和长非编码RNA MALAT1。HDAC9-MALAT1-BRG1复合物结合染色质并抑制收缩蛋白基因表达，与组蛋白H3-赖氨酸27三甲基化修饰的获得相关。阻断Malat1或Hdac9可以恢复收缩蛋白的表达，改善主动脉壁结构，并抑制实验性动脉瘤的生长。因此，我们强调了共同的表观遗传途径导致两种TAA形式的VSMC功能障碍，对其他已知的HDAC9相关血管疾病具有潜在的治疗意义。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
HDAC9上调与TAA相关的人类遗传变异有关。一 转化生长因子βV和SMCV公司基因群。b条siSMAD3中常见失调基因mRNA表达的热图（HDAC9倍变化 = 1.6）和siACTA2（HDAC9折叠变化 = 2.0）经处理的人类VSMC。比例尺指示折叠变化Z轴-得分。c（c）对siSMAD3、siTGFB2、siACTA2和siMYH11处理细胞中HDAC9转录诱导的QPCR验证。绘制了四个实验重复。d日用空载体TGFR2转染人VSMC中HDAC9转录物的QPCR分析g357瓦或ACTA2179兰特等位基因。绘制了四个实验重复。e（电子）定量western blot分析HDAC9在细胞核和细胞质提取物中的分布表明TGFR2增加了细胞核定位G357瓦或ACTA2179兰特等位基因。对三个实验重复进行了量化。（f）siHDAC9治疗VSMC逆转TGFR2表达诱导的MMP活性G357瓦或ACTA2179兰特通过体外明胶酶谱测定人血管平滑肌细胞的等位基因。克siHDAC9治疗VSMC可缓解TGFR2表达诱导的迁移活动抑制G357瓦或ACTA2179兰特通过伤口愈合试验检测人类VSMC中的等位基因。0和48时伤口愈合试验的连续显微照片 如图所示，VSMC为红色。条形图 = 200 微米。小时TAA患者和非动脉瘤对照组人主动脉组织核提取物中HDAC9蛋白的定量western blot分析。我免疫荧光染色显示HDAC9蛋白在不同类型TAA病因的人类TAA样本中的核定位相似。主动脉腔向右。（20×，巴 = 50 微米；100×，巴 = 10 微米）。家族性胸主动脉瘤与解剖；TAA，胸主动脉瘤。条形图表示为带误差条（±S.D.）的平均值，学生T型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT.补充图8中显示的全长蛋白质印迹
图2
图2
TAA相关的人类基因变异会破坏肌动蛋白细胞骨架的稳定性。一TGFR2转染VSMC的免疫荧光G357瓦或ACTA2179兰特等位基因（通过抗V5染色鉴定，左栏）和抗HDAC9染色（红色，右栏），通过抗F-actin染色证明有组织的肌动蛋白细胞骨架结构的丧失（绿色，两栏）。酒吧 = 20 µM，箭头表示3倍变焦插入面板的焦点。b条Western blot显示TGFR2组α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、钙调素（CNN1）和平滑蛋白（SMTN1）表达减少G357瓦或ACTA2179兰特表达细胞。对三个实验重复进行了量化。c（c）与对照主动脉组织相比，人主动脉样本（顶行）的Masson三色染色（蓝色）代表胶原沉积，来自不同病因（底行）的人TAA样本的免疫荧光显示，抗SM22α（洋红，所有列）的F-actin染色（绿色）减少。注意，F-actin染色在无定形弹性蛋白纤维自身荧光之间。（20×，巴 = 50 微米；63×，棒材 = 15 微米）。d日肌动蛋白分级分析显示TGFR2降低了F-Actin与G-Actin的比率G357瓦或ACTA2179兰特表达细胞。对三个实验重复进行了量化。条形图表示为带误差条（±S.D.）的平均值，学生T型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT.补充图8中显示的全长蛋白质印迹
图3
图3
HDAC9与BRG1和lncRNA MALAT1相互作用。一TGFR2中HDAC9蛋白表达增加G357瓦或ACTA2179兰特与人类VSMC中其他HDAC亚型相比，通过western blot表达等位基因。对三个实验重复进行了量化。b条BRG1的免疫沉淀显示HDAC9在TGFR2中结合G357瓦和ACTA2179兰特表达突变细胞。三个重复实验的蛋白质水平定量。c（c）Top，CLIP-seq对抗HDAC9和抗BRG1免疫复合物的分析，如文氏图所示，显示在基线或TGFR2表达期间用两种抗体纯化检测到的转录物数量g357瓦或ACTA2179兰特等位基因。底部，通过巧妙途径分析107个核心转录物的细胞功能。d日TGFR2表达期间已知心血管lncRNA的定量PCR分析G357瓦或ACTA2179兰特等位基因。e（电子）与抗HDAC9或抗BRG1免疫复合物相关的心血管lncRNA的定量PCR分析。四个实验重复被量化。（f）BRG1和HDAC9的连续免疫沉淀证明了lncRNA MALAT1与BRG1-HDAC9免疫复合物的关联。三个重复实验的蛋白质水平定量。克通过珠固定化生物素化MALAT1或LacZ反义RNA探针的UV交联捕获的HDAC9和BRG1蛋白的Western blot分析。对三个重复进行量化。小时HDAC9和BRG1的免疫荧光表明，HDAC9在siMALAT1处理的细胞中缺乏核定位。酒吧 = 15 µM，圆圈表示siMALAT处理细胞中的细胞核位置，箭头表示明显的HDAC9细胞质聚集。我对来自对照组和siMALAT1处理的VSMC的核提取物（NE）和细胞质提取物（CE）的HDAC9和HDAC1进行半定量western blot分析。j个siMALAT1治疗VSMC降低TGFR2G357瓦或ACTA2179兰特通过体外明胶酶谱介导MMP活性的诱导。条形图表示为带误差条（±S.D.）的平均值，学生T型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT.补充图8中显示的全长蛋白质印迹
图4
图4
HDAC9–MALAT1–BRG1复合物负调控平滑肌收缩基因。一荧光原位杂交（FISH）显示TGFR2中MALAT1水平增加G357瓦或ACTA2179小时表达细胞，（学生的T型-测试**第页 < 0.01). 酒吧 = 15 微米b条MALAT1、BRG1和HDAC9在TGFR2中的空间共定位G357瓦-表达或ACTA2179兰特-表达细胞。3D超分辨显微镜显示TGFR2中HDAC9（绿色）、MALAT1（红色）和BRG1（黄色）的核内共定位G357瓦或ACTA2179兰特表达细胞。显示了每种情况下100个细胞中BRG1-HDAC9和BRG1-MALAT1之间空间重叠的Global Pearson共定位（GPC）。酒吧 = 2 µM上面板，Bar = 1.2 µM下面板(c（c）)合成和收缩SMC表型分子标记的定性PCR分析，主要证明TGFR2中收缩标记的抑制G357瓦或ACTA2179兰特表达VSMC(*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT）量化了四个实验重复。d日ChIP显示TGFR2收缩基因启动子处H3K27me3标记增加G357瓦或ACTA2179兰特表达细胞(*第页 < 0.05 vs.WT）。染色质免疫沉淀分析（ChIP）显示，在收缩性VSMC基因的启动子处，包括CNN1（calponin）、TAGLN（Sm22）、SMTN（smoothlin）、VCL（vinculin）和cTNN3（肌钙蛋白），通过RNA纯化（ChiRP）MALAT1 RNA，HDAC9和BRG1蛋白的占有率增加，染色质分离（Student’sT型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT）。四个实验重复被量化。e（电子）BRG1和HDAC9的系列免疫沉淀（ReChIP）显示BRG1-HDAC9免疫复合物与VSMC收缩启动子的MALAT1依赖性关联。对三个重复进行量化。条形图表示为带误差条（±S.D.）的平均值，学生T型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01与WT
图5
图5
HDAC9–MALAT1–BRG11是EZH2募集到染色质所必需的。一合成和收缩基因的定性PCR分析显示TGFR2中HDAC9和MALAT1依赖性抑制G357瓦或ACTA2179兰特表达VSMC。b条HDAC9染色质免疫沉淀分析（ChIP）显示MALAT1和BRG1与VSMC启动子的依赖性关联。c（c）MALAT1荧光原位杂交（FISH）显示与H3K27me3标记和致密异染色质区域共定位（虚线）。酒吧 = 1.2 µM，顶排和中排，Bar = 120 nM，最下面一行(d日)体外表达EZH2的Western blot显示与TGFR2中BRG1和HDAC9免疫沉淀物的顺序相关G357瓦或ACTA2179兰特表达细胞。e（电子）染色质免疫沉淀分析（ChIP）显示EZH2与VSMC启动子的HDAC9、BRG1和MALAT1依赖性关联。（学生的T型-测试，NS不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT）条形图表示为带误差条的平均值（±S.D.），学生的T型-测试*第页 < 0.05, **第页 < 0.01 vs.WT.补充图8中显示的全长蛋白质印迹
图6
图6
Malat1或Hdac9基因突变可改善实验性主动脉瘤。一从中解释的VSMCFbn1公司1039克/+与野生型细胞相比，小鼠主动脉Hdac9-Brg1和Malat1-Brg1的共定位增强。图中显示了Hdac9–Brg1和Malat1–Brgl之间空间重叠的Global Pearson共定位（GPC）。酒吧 = 2.5 微米b条野生型Hdac9–Malat1–Brg1复合物和Fbn1公司103克/+通过共聚焦显微镜观察升主动脉标本。酒吧 = 40 微米c（c）的QPCRHdac9型,马拉特1、和轴承1在中显示上调Fbn1公司103克/+主动脉条形图表示为带误差条的平均值（±S.D.）n个 = 6只6个月大的动物(d日)改进的主动脉定量尺寸Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−和Fbn1型1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：标记核心小鼠与Fbn1公司1039克/+老鼠。主动脉根部（红色）和升主动脉（黑色）超声定量野生型(n个 = 18),马拉特1−/−(n个 = 18),Hdac9型飞行/飞行：标记核心(n个 = 17)，第1层1039克/+(n个 = 24),Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−(n个 = 19） 、和Fbn1公司1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：标记核心(n个 = 15; 单向方差分析*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001). 显示6个月时的主动脉尺寸和16至24周之间的主动脉生长。6月龄小鼠胸骨旁长轴收缩超声主动脉根部的典型图像。红色箭头表示主动脉根部，白色箭头表示升主动脉。酒吧 = 1 毫米(e（电子）)Malat1和Hdac9缺陷可挽救Fbn1公司1039克/+主动脉。六个月龄注射乳胶野生型的代表性显微照片，马拉特1−/−，Hdac9型飞行/飞行：标记面积，Fbn11039克/+,Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−、和Fbn1公司1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：Tagln克心脏和升主动脉（左栏，Bar = 1 mm，中柱和右柱，棒材 = 40 微米）。红色箭头表示主动脉的上升部分。主动脉用Verhoeff-Van-Gieson染色（中央面板）和F-actin免疫荧光染色（右面板）。主动脉外膜面向左侧，而主动脉腔面向右侧。主动脉构筑定量和F-actin染色（单向方差分析*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001). 补充图8所示的全长蛋白质印迹
图7
图7
Malat1或Hdac9的基因破坏可恢复体内收缩蛋白的表达。一 马拉特1或Hdac9型缺乏降低体内主动脉MMP活性Fbn1公司1039克/+老鼠。野生型，Fbn1公司1039克/+、和Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−、和Fbn1公司1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：标记核心小鼠在处死和离体成像之前在体内注射MMP sense 680。酒吧 = 1.5 毫米。b条6个月大的升主动脉收缩和合成VSMC标记物的热图Fbn1公司1039克/+,Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−、和Fbn1型1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：标记核心老鼠。通过折叠变化（FC）与野生型显示的水平。(n个 = 每个基因型7只小鼠）。c（c）小鼠主动脉组织体内染色质免疫沉淀（ChIP）分析(n个 = 每个基因型6只小鼠）在近端使用H3K27me3抗体胶转蛋白（Sm22α）启动子。d日 马拉特1或Hdac9型缺乏可挽救多种VSMC收缩蛋白表达减少Fbn1公司1039克/+老鼠。野生型主动脉的Western blot，马拉特1−/−，第1层1039克/+,Fbn1公司1039克/+：马拉特1−/−、和Fbn1公司1039克/+:Hdac9型飞行/飞行：标记核心老鼠。显示了三个重复实验的蛋白质水平的量化。（学生的T型-测试，NS不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01）条形图表示为带误差条（±SD）的平均值。补充图9中显示的全长蛋白质印迹
图8
图8
疾病诱导的HDAC9–BRG1–MALAT1复合物的转录抑制。一在健康主动脉中，负责正常主动脉内稳态的基因由多种转录因子（TF）转录，如MEF2、Myocardin和Myocardian相关转录因子（MRTF）。b条疾病过程激活HDAC9–BRG1–MALAT1复合物的组装。通过复合物的作用和通过多梳抑制复合物2（PRC2）获得组蛋白3赖氨酸27三甲基化，靶基因的启动子沉默。c（c）减少MALAT1和/或HDAC9的剂量会导致复合物不稳定，并允许沉默基因位点的表达和有害表型的逆转
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