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.2018年2月20日;12:86。
doi:10.3389/fnins.2018.00086。 eCollection 2018年。

ALS-iPSC源性运动神经元蛋白聚集与热休克反应的模拟

隶属关系
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iPSC运动神经元热休克反应的蛋白质模拟

艾米莉神学院等等。 前部神经病变. .
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摘要

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种破坏性的神经退行性疾病,其原因是选择性地丧失上下运动神经元。在所有病例中,只有10%是由24个不同基因中的一个突变引起的,而剩下的90%可能是由尚未确认的遗传因素和环境因素共同造成的。突变C9orf72,SOD1,或TDP-43是家族性肌萎缩性侧索硬化症最常见的病因,加在一起至少占60%。值得注意的是,尽管存在很大程度的异质性,但所有ALS病例的大脑和脊髓中都有SOD1、TDP-43、OPTN和/或p62免疫阳性的蛋白质聚集体。这些包涵体通常被热休克蛋白(Hsps)阻止和清除,这表明ALS运动神经元诱导热休克反应(HSR)的能力受损。因此,有证据表明,与未受影响的对照组相比,在ALS小鼠模型和人类死后样本中,Hsps的诱导减少。然而,热休克蛋白在人类运动神经元蛋白质积累中的作用尚未完全阐明。在这里,我们从携带突变的人类诱导多能干细胞(iPSC)细胞系中培养出运动神经元SOD1,TDP-43,或C9orf72. 在这项研究中,我们提供了证据,尽管缺乏明显的运动神经元丢失,但在iPSC衍生的运动神经元培养物中仍有不溶的、易聚集的蛋白质积累,但其含量和水平随遗传背景而变化。此外,虽然iPSC衍生的运动神经元通常能够在热应激下诱导HSR,但蛋白质聚集本身并不足以诱导HSR或应激颗粒的形成。因此,我们得出结论,ALS-iPSC来源的运动神经元再现了疾病的早期主要病理特征,并且不能内源性上调HSR以应对蛋白质负荷的增加。

关键词:BAG3;C9orf72;HspB1;HspB8;OPTN;SOD1;TDP-43;应力颗粒。

数字

图1
图1
来自多个ALS基因型的iPSC来源的运动神经元在培养中没有表现出降低的活性。(一)对照组和ALS运动神经元分化3周时的代表性图像,Tuj1(绿色)、ChAT(红色)和胰岛1(白色)免疫染色。细胞核用Hoechst核染料(蓝色)标记。比例尺=50μm。(二)量化显示在分化3周或4周时运动神经元的数量没有差异。n=3–4。Tukey单因素方差分析不显著事后测试。
图2
图2
SOD1在SOD1和C9orf72运动神经元中溶解度的改变。(一)分化4周时,Hoechst核染色(蓝色)、SOD1(绿色)和Tuj1(白色)的典型免疫细胞化学图像显示,ALS运动神经元中SOD1+斑点的神经元数量与对照组(ns)相比没有显著差异,p>单因素方差分析0.05事后测试)。与对照组相比,C9orf72和TDP-43运动神经元的SOD1+点更少(*p<0.05,采用Tukey单因素方差分析事后测试)。n=3,比例尺=10μm(全像)或2μm(展开)。(二)SOD1的westernblot检测结果显示,ALS株系与对照系之间无显著差异。将数据标准化为还原总蛋白染色,并表示为对照组(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试,n=3–6)。(三)滤过陷阱实验显示,SOD1和C9orf72运动神经元中不溶性SOD1水平呈上升趋势,但在iPSC集落(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。数据表示为折叠转换控制。n=3。
图3
图3
TDP-43在运动神经元中溶解度的变化。(一)分化4周时的代表性图像显示,在ALS运动神经元培养中,胞浆内有TDP-43+斑点的神经元数量或每个神经元的TDP-43+小点的数量没有变化(ns,p>单因素方差分析为0.05)。n=3,比例尺=10μm(全像)或2μm(展开)。(二)TDP-43在ALS运动神经元培养中的蛋白水平无显著差异。将数据标准化为还原总蛋白染色,并表示为对照组(ns,p>单因素方差分析0.05,n=3–5)。(三)TDP-43的过滤陷阱分析显示TDP-43运动神经元的不溶性水平有增加的趋势,但在iPSC集落(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。数据表示为折叠转换控制,n=3。
图4
图4
OPTN不溶于SOD1和C9orf72运动神经元。(一)分化4周时Hoechst核染色(蓝色)、OPTN(绿色)和Tuj1(白色)的典型免疫细胞化学图像。OPTN+puncta神经元数目无明显差异(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。n=3,比例尺=10μm(全像)或2μm(展开)。(二)经westernblot检测,OPTN总蛋白水平无明显变化。数据标准化为还原总蛋白,并表示为对照组(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。n=3。(三)OPTN过滤陷阱分析显示,SOD1和C9orf72运动神经元(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。在一株C9orf72株iPSC株的菌落中观察到不溶性OPTN,但在其他菌株中没有观察到。数据表示为折叠转换控制,n=3。
图5
图5
ALS运动神经元改变了HspB1、HspB8和BAG3的表达。(一)ALS iPSC源性运动神经元的BAG3、HspB1和HspB8转录水平没有显著增加,n=3–6。(二)BAG3的Western印迹显示TDP-43运动神经元增加。数据被标准化以还原总蛋白,并表示为对照组的倍数变化(*p通过方差分析得出<0.05事后测试,n=3)。(三)HspB1(绿色)和HspB8(红色)免疫细胞化学定量显示,在SOD1运动神经元中,HspB8蛋白水平显著升高(*p<0.05,采用Tukey单因素方差分析事后测试,n=3)。比例尺=50μm。(四)磷酸化HSF1在S326的Western印迹显示,在ALS运动神经元中没有明显的HSR诱导。数据标准化为还原总蛋白,并表示为对照组(ns,p>单因素方差分析0.05事后测试)。n=3。
图6
图6
SOD1和C9orf72运动神经元在急性热应激后诱导HSR。(一)在热休克1小时后,SOD1和C9orf72运动神经元的HspB1、HspB8和BAG3的转录水平比未经处理的样本增加。数据标准化为未经处理的对照(**p<0.01,*p<0.05学生t-测试)。n=3–4。(二)在S326处磷酸化HSF1的Western blot显示,与热休克1小时后,对照组和SOD1运动神经元培养的HSR相比,HSR有显著的诱导作用。图5D中未经处理的蛋白质印迹图再次显示,以便于比较。数据标准化为还原总蛋白染色,并以未处理对照样品的倍数变化表示。(**p<0.01,*p<0.05学生t-测试)。n=3–4。
图7
图7
肌萎缩侧索硬化运动神经元不显示应激颗粒形成增强。(一)Tuj1(白色)和G3BP(红色)的免疫细胞化学显示至少有一个G3BP+点的神经元数量没有差异,但C9orf72运动神经元每个神经元的G3BP+点较少(*p<0.05,采用Tukey单因素方差分析事后测试)。n=3,比例尺=2μm。(二)G3BP的Western印迹显示未经治疗或热休克运动神经元(ns,p>0.05(学生)t-测试)。数据标准化为还原总蛋白染色,并以未处理对照样品的倍数变化表示。

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