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.2018年5月；39(5):2114-2126.
doi:10.3892/或.2018.6297。 Epub 2018年3月6日。

DDP抑制YAP干扰结肠肿瘤进展

李坤 1, 郭继伟 2, 吴彦（Yan Wu） 2, 丹金（Dan Jin） 三, 洪江 4, 刘成霞 5, 秦成勇 1
附属公司

DDP抑制YAP干扰结肠肿瘤进展

李坤等。 及国际医学权威期刊. 2018年5月.

缩回

  • [Retracted]DDP抑制YAP干扰结肠肿瘤的进展。
    李凯，郭杰，吴毅，金德，姜浩，刘C，秦C。 李凯等。 Oncol Rep.2021年1月；45(1):406. doi:10.3892/或.2020.7843。Epub 2020年11月9日。 Oncol报告2021。 PMID：33169798 免费PMC文章。

摘要

结肠癌是一种常见的诊断癌症，通常预后较差。结合肿瘤治疗药物耐药性的发展，结肠癌的治疗效果可能有限。癌基因YAP的激活已被证明与结肠癌的进展有关，并与预后不良、耐药性和转移相关，即使在治疗中。顺铂（DDP）是一种常用的控制肿瘤进展的药物，尽管其机制尚不清楚。在本研究中，我们检测了DDP是否特异性抑制YAP以抑制结肠癌的进展。我们的数据显示，Mst/Yap信号在结肠癌中异常激活，促进细胞增殖和侵袭。DDP治疗降低了YAP在转录和翻译后水平的表达，导致癌细胞的细胞周期阻滞、凋亡和衰老，此外还降低了上皮-间充质转化、细胞运动和体外细胞侵袭和迁移。最终，DDP增加了E-cadherin的表达，降低了vimentin的表达。本研究还揭示了YAP磷酸化的翻译后调控控制了细胞核和细胞质之间的亚细胞分布。总之，本研究的结果表明，DDP是一种针对Mst/Yap信号通路的结肠癌合适的治疗候选药物。

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数字

图1。
图1。
患者结肠肿瘤中YAP的异常激活。（A） RT-PCR检测显示，与邻近的正常组织相比，人类结肠组织中YAP mRNA表达增加。（B） Western blot分析表明，与邻近正常组织相比，人类结肠组织中的YAP蛋白水平也增加。（C） YAP表达的Kaplan-Meier OS曲线（n=1926，P=1E-09，使用显著性的log-rank检验）。（D） 染色YAP的免疫荧光显示LoVo和SW620结肠癌细胞相对于正常NCM460细胞系的总蛋白水平增加，核YAP定位增加。这与p-YAP表达降低有关。结果以平均值±标准差表示，误差条代表三个独立实验的标准差***与对照组相比P＜0.001。OS，整体生存。
图2。
图2。
YAP敲除抑制细胞生长和侵袭。（A） 与对照细胞相比，SW620细胞暴露于YAP特异性shRNA后YAP mRNA和蛋白表达水平的RT-PCR和western blot分析。（B） 与对照细胞相比，SW620细胞中YAP稳定过度表达后YAP mRNA和YAP蛋白水平的RT-PCR和western blot分析。（C）体外在YAP过度表达的SW620细胞中，增殖被促进，而在YAP敲除的细胞中，其增殖被降低。（D） 与对照细胞相比，在SW620细胞中使用YAP特异性shRNA敲除YAP后，YAP和Ki-67的免疫荧光染色降低。（E） 集落形成分析表明，在YAP过度表达的细胞中集落形成增加，而在YAP敲除的细胞中，集落形成减少。（F） 划痕分析显示，36小时后，稳定过表达的YAP细胞在SW620细胞中的细胞迁移增加，而YAP敲除细胞的细胞迁移减少。（G） Transwell分析表明，与对照细胞相比，YAP过表达细胞在SW620细胞中的侵袭和迁移增加，而YAP的敲除导致侵袭和迁移减少。结果以平均值±SD表示，误差条代表三个独立实验的SD**P<0.01***与对照组相比，P<0.001。
图3。
图3。
DDP降低结肠肿瘤细胞中YAP的活性。（A和B）RT-PCR和免疫印迹分析表明，DDP处理在指定的浓度和时间点降低了SW620细胞中的YAP mRNA和YAP蛋白水平。（C） 在使用SW620和LoVo细胞的荧光素酶报告分析中，DDP对YAP启动子荧光素素酶活性的影响。（D） 基于凝胶的RT-PCR和western blot分析表明，与对照细胞相比，DDP处理的SW620细胞中YAP、CYR61和CTGF的mRNA和蛋白表达水平降低。（E） 与对照组相比，DDP处理后SW620细胞中YAP、CYR61和CTGF蛋白的免疫荧光染色显示表达降低。（F） YAP和p-YAP免疫荧光染色显示，用6µg/ml DDP处理SW620细胞36 h后，YAP从细胞核向细胞质的移位和p-YAP增强。（G） Western blot分析表明，6µG/ml DDP处理36 h后，YAP在SW620细胞细胞核中的定位降低，在细胞质中的定位增强。结果以平均值±SD表示，误差条代表三个独立实验的SD*P<0.05**P<0.01***与对照组相比，P<0.001。顺铂。
图4。
图4。
DDP影响YAP介导的结肠细胞增殖。（A）体外增殖测定和（B）细胞生长测定表明稳定过表达YAP的细胞在SW620中显示出增加的细胞增殖，并且用DDP处理后的LoVo细胞阻断了YAP诱导的细胞增殖。YAP敲除细胞显示细胞增殖受阻。（C） Ki-67蛋白的免疫荧光染色显示DDP处理后SW620细胞增殖降低。（D） 在稳定过度表达的YAP细胞中，集落形成增加，而在YAP敲除细胞中，则减少。然而，DDP部分减少了YAP诱导的SW620细胞集落形成。结果以平均值±标准差表示，误差条代表三个独立实验的标准差**P＜0.01***与对照组和#**P<0.01；#***与联合治疗相比，P<0.001。顺铂。
图5。
图5。
DDP影响SW620细胞的细胞周期并诱导其凋亡。（A） 细胞周期分析显示，用10µg/ml DDP处理72小时后，SW620细胞阻滞在G2期的比例增加，尽管YAP过度表达和YAP的敲除分别部分阻断或促进了这种作用。（B） Annexin V染色和流式细胞术表明，用10µg/ml DDP处理72 h后，SW620细胞的凋亡显著降低。YAP的异位过度表达阻断了DDP诱导的凋亡，而用shRNA敲除YAP部分促进了凋亡。（C） 免疫印迹分析显示，与SW620对照细胞相比，DDP处理后的裂解caspase-3蛋白水平增加。YAP的异位表达部分阻断了DDP诱导的caspase-3的表达，而使用shRNA敲低YAP可促进caspase-2的表达**经Student t检验，P<0.001，***P<0.0001。（D） 裂解的caspase-3的免疫荧光染色证实，DDP增加了该蛋白的水平，而YAP的异位表达部分阻断了DDP诱导的caspase-3的表达。结果以平均值±SD表示，误差条代表三个独立实验的SD**P<0.01***与对照组和#**P<0.01；#***与联合治疗相比，P<0.001。顺铂。
图6。
图6。
DDP影响YAP介导的结肠癌细胞衰老、侵袭性和EMT。（A） SA-β-Gal分析表明，用10µg/ml DDP处理SW620细胞72小时后，细胞衰老加剧。稳定过表达YAP的细胞部分阻止衰老，而YAP敲除细胞显示DDP诱导的衰老增加。（B） 用10µg/ml DDP处理72 h后，在YAP稳定过表达或不稳定过表达的细胞和用shRNA敲除YAP的细胞中，显示细胞形态的相差显微镜显著改变。（C）划痕试验表明，用10µg/ml DDP处理SW620细胞36小时后，YAP诱导的细胞迁移增加减少。（D） Transwell分析表明，与对照细胞相比，暴露于10µg/ml DDP 72小时可减少SW620细胞的细胞侵袭和迁移。稳定过度表达的YAP细胞显示部分阻断了DDP诱导的细胞侵袭性生长和迁移，而YAP敲除细胞显示增加了细胞侵袭性增长和迁移。（E和F）RT-PCR和免疫印迹分析显示，10µg/ml DDP处理72 h后，SW620细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白水平显著增加，而vimentin表达降低。稳定过表达YAP的细胞部分阻断了DDP诱导的E-钙粘蛋白和波形蛋白表达的表达变化，而使用shRNA敲低YAP的细胞表现出相反的作用。（G） 与对照细胞相比，用10µG/ml DDP处理72 h后，E-cadherin蛋白的免疫荧光染色显示其表达增加。稳定过表达的YAP细胞部分阻断DDP诱导的E-cadherin表达，而YAP敲除细胞促进E-cadherin表达。结果显示为平均值±SD，误差条代表三个独立实验的SD**P<0.01***与对照组和#*P＜0.05；#***与联合治疗相比，P＜0.001。顺铂。
图7。
图7。
DDP抑制就地结肠异种移植物体内（A）用对照（PBS）或DDP治疗患有结肠癌细胞瘤的异种小鼠，并在常规时间点评估肿瘤的大小和重量。（B） 总体肿瘤大小和生长曲线。（C） 用H&E显微镜观察经对照（PBS）和DDP治疗的裸鼠皮下异种移植物中原代SW620细胞的结肠肿瘤结节。免疫组织化学染色显示，与PBS治疗相比，DDP治疗后异种移植瘤组织中YAP的表达降低。（D） 异种结肠癌细胞瘤裸鼠的大肠、小肠、胃、心脏、肝脏、脾脏、结肠和肾脏的典型H&E染色显微图像。与PBS处理的小鼠相比，DDP处理的小鼠的器官损伤不太明显。（E） DDP治疗后裸鼠的体重与PBS治疗后的裸鼠相比表明，DDP治疗不会显著改变动物的体重，也可以减轻体重减轻。（F） PBS和DDP处理小鼠的Kaplan-Meier OS曲线。结果以平均值±SD表示，误差条代表三个独立实验的SD*P<0.05***与对照组相比，P<0.001。顺铂；OS，总体生存率；H&E、苏木精和曙红；PBS，磷酸盐缓冲盐水。
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