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.2018年3月22日；173（1）：104-116.e12。
doi:10.1016/j.cell.2018.02.014。 Epub 2018年3月1日。

细胞周期调控刺激成年心肌细胞增殖和心脏再生

Tamer M A穆罕默德 1, 颜信昂 2, 伊桑·拉金斯基 2, Ping Zhou公司 2, 于晃（音） 2, 阿耶·埃尔芬贝因 2, 艾米·福利 2, 谢尔盖·马格尼茨基 三, 塔瓦 4
附属公司

细胞周期调控刺激成年心肌细胞增殖和心脏再生

Tamer M A穆罕默德等。 单元格. .

摘要

人类疾病通常是由失去无法重新进入细胞周期进行再生修复的体细胞引起的。在这里，我们报道了一种细胞周期调节因子的组合，可在成年有丝分裂后细胞中诱导稳定的胞质分裂。我们筛选了在增殖的胎儿心肌细胞中表达的细胞周期调节因子，发现过度表达细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、CDK4、细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白D1可有效诱导有丝分裂后小鼠、大鼠和人心肌细胞的细胞分裂。通过蛋白酶体介导的蛋白质产物降解，细胞周期调节因子的过度表达是自我限制的。体内谱系追踪显示，表达这四种因子的成年心肌细胞中有15%至20%的细胞分裂稳定，急性或亚急性心肌梗死后心功能显著改善。Tgf-β和Wee1的化学抑制使CDK1和细胞周期蛋白B可有可无。这些发现揭示了一种离散的基因组合，可以有效地释放最终退出细胞周期的细胞的增殖潜能。

关键词：CDK；心肌细胞；细胞周期；细胞分裂；细胞周期蛋白；胞质分裂；心脏；心力衰竭；增殖；再生。

PubMed免责声明

利益冲突声明

权益声明

T.M.A Mohamed和D.Srivastava提出了一项题为“诱导心肌细胞细胞分裂的方法”的专利申请（公布的PCT申请号：WO2016/164371）。

数字

图1
图1。促进心肌细胞磷酸组蛋白3（PHH3）表达的胎儿细胞周期基因的筛选
（A）行标准化Z评分热图（n=3的平均值）显示了与胎儿（E10.5）、新生儿（P1）和成年（8周龄）小鼠心脏细胞周期调节相关的差异表达基因的选定转录组数据。（B）条形图显示心肌细胞的百分比（cTnT+)腺病毒感染48小时后，细胞核磷酸化氢istone H3（PHH3）阳性，在出生后第7天（P7）的小鼠原代心肌细胞中过度表达指示蛋白。（C，D）感染对照腺病毒或表达CDK1-CCNB-AURORA腺病毒的P7原代小鼠心肌细胞（C）或60天龄人iPS衍生心肌细胞（D）的免疫细胞化学，并在48小时后用PHH3（红色）、心肌肌钙蛋白T（绿色）和DAPI（蓝色）抗体进行免疫染色以标记细胞核；插图表示单元格的放大倍数更高。另请参见图S1。
图2
图2。CDK1-CDK4-CCNB-CCND诱导EDU-和PHH3阳性的人、小鼠和大鼠心肌细胞体外试验
（A）对照组或CDK1-CDK4-CCNB-CCND（4F）病毒感染48小时后60天龄人iPS-CMs中PHH3、EDU、心脏肌钙蛋白T（cTnT）和Dapi的代表性免疫细胞化学图像，显示为高倍插图。(B）EDU的量化+：cTnT+或PHH3+：cTnT+CMs细胞核对60天龄人类iPS-CMs中指示蛋白过度表达的反应（n=3个独立实验，*p<0.05）。(C）用表达腺病毒的LacZ（对照组，顶屏）或4F（CDK1-CDK4-CCNB-CCND，下屏）感染P7原代小鼠心肌细胞（顶屏）和4月龄成年大鼠心肌细胞（下屏），48小时后用PHH3（绿色）、cTnT（红色）和DAPI核染色（蓝色）进行代表性免疫细胞化学染色；插图表示放大倍数更高。(D）小鼠或大鼠cTnT的定量+PHH3心肌细胞+占总cTnT的百分比+电池（n=260个电池cTnT+计算每种类型）。条形图表示三个实验的平均值，误差条形图表示SEM（*p<0.05）。另请参见图S1。
图3
图3。细胞分裂后双标记（MADM）基因标记心肌细胞的镶嵌分析及细胞因子的揭示在体内带4F
（A、B）代表性免疫荧光图像和单色（红色或绿色）细胞的定量，表明α-MHC MER-CRE-MER MADM小鼠组织学切片（A）中发生胞质分裂的心肌细胞，或4月龄成年小鼠CRE诱导后分离的心肌细胞（B）。（A）中的下部面板表示放大倍数较高。无色或双标记细胞不适合胞质分裂。在心肌梗死诱导时，向小鼠心肌内注射编码CDK1、CCNB、CDK4和CCND（4F）的腺病毒或控制Lac-Z病毒的腺病毒（每组6-8只动物，（每组分析8000个细胞）*p<0.05）。（C）心肌梗死后感染4F病毒或对照组（cTnT）-CRE MADM小鼠单色心肌细胞的代表性图像和定量（每组3只动物，分析8000个细胞/组）*p<0.05）。（B）和（C）中的4F行表示不同的细胞或组织区域。条形图表示SEM实验的平均值；采用学生t检验对两组进行比较。另请参见图S2–S6。
图4
图4。心肌细胞以蛋白酶体依赖的方式降解过度表达的细胞周期蛋白
（A）冠状动脉结扎和4F感染后1、2和3周α-MHC-Cre MADM小鼠单色细胞的定量。在第一周单色细胞数量首次增加后，没有进一步增加（每组四只动物的600个细胞分析）。(B)条形图显示了感染后2天和6天过度表达的细胞周期基因的RNA表达（左侧面板）和蛋白质表达（右侧面板）（n=3，*p<0.05）。(C类)代表性免疫荧光图像和指示蛋白（绿色）和心脏肌钙蛋白T（红色）随时间的定量显示，在每种腺病毒感染后第6天，过度表达的蛋白表达下降（n=3个独立实验，*p<0.05）。(D类)代表性图像（用于CCNB）和cTnT的定量+从第4天开始，用蛋白体抑制剂（硼替佐米或MG132）处理心肌细胞48小时后，在蛋白体抑制剂存在的情况下，第6天过度表达的细胞周期基因持续蛋白表达（n=3，*p<0.05）。条形图表示平均值和SEM。此外，见图S7。
图5
图5。CDK1:CCNB:CDK4:CCND（4F）表达增强小鼠急性或亚急性心肌梗死后的心功能
（A）心肌梗死12周后和梗死时注射腺病毒后的典型横向磁共振成像（MRI）显示，对照组梗死部位的心室壁变薄，接受4F治疗的动物的情况有所改善（箭头所示）。显示了从心室室底部（顶点）到顶部（底部）的多个图像。（B）与对照组小鼠相比，4F治疗组小鼠的射血分数、中风量、心输出量和疤痕大小（通过所有心脏切片）均显著改善（n=9，*p<0.05）。（C）通过多层心脏（心尖（1）至心底（4））的代表性组织切片，采用Masson三色染色，显示瘢痕组织为蓝色，健康心肌为红色，有无4F治疗。条形图显示了通过组织学（通过方法中描述的1-4级）对疤痕大小的量化（n=9，*p<0.05）。横线表示平均值，误差横线表示SEM。使用学生t检验对两组进行比较。（D）心肌梗死12周后和梗死1周后注射病毒的典型MRI图像显示，对照组梗死部位的壁变薄，接受4F治疗的动物的情况有所改善。（E）与对照组小鼠相比，4F治疗组小鼠的射血分数、中风量、心输出量和MRI测量的瘢痕大小显著改善（n=9，*p<0.05）。横条表示SEM的平均值。（F）损伤后一周，用Masson’s三色染色法对心脏的多个层面进行代表性组织切片，进行4F治疗和不进行4F处理。条形图显示了组织学对疤痕大小的量化（n=9，*p<0.05）。此外，见图S7。
图6
图6。CDK4和CCND通过短暂Wee1和TGFβ抑制（2F2i）诱导心肌细胞增殖并增强损伤后的心功能
（A）量化PHH3数量的直方图+cTnT中的细胞核+在存在或不存在Wee1抑制剂（MK1775）和TGFβ抑制剂（SB431542）的情况下，根据指示的因子组合表达人类iPS-CM（*p<0.05）。(B)α-MHC MER-CRE-MER MADM小鼠组织切片中单色（红色或绿色）细胞的代表性免疫荧光图像和定量，表明心肌细胞经历了胞质分裂（每组4只动物*p<0.05）。（C）与对照组小鼠相比，2F2i和4F-治疗组小鼠在3个月后通过盲法MRI测量的射血分数、中风量、心输出量和疤痕大小（通过所有心室心脏切片）也有类似的改善（n=8，*p<0.05）。（D）经LacZ-2i、2F2i或4F处理后，用Masson三色染色法对多层心脏（心尖[1]向心底[4]）进行代表性组织切片，显示瘢痕组织为蓝色，健康心肌为红色。条形图显示了组织学对疤痕大小的量化（按照方法所述，通过1-4级）（n=8，*p<0.05）。横线表示平均值，误差横线表示SEM。使用单向方差分析比较三组之间的差异。
图7
图7。Wee1和TGFβ抑制（2i）限制CDK4和CCND诱导的P27激活
（A）48小时后，在存在或不存在2i的情况下，过度表达LacZ控制病毒或2F（CDK4/CCND）的人类iPS-CMs中P27表达的代表性蛋白质印迹和定量（n=3个独立实验，*p<0.05）。条形图表示每个蛋白质带的图像密度相对于GAPDH强度的平均比率，以及SEM。（B）使用P27 siRNA和加扰（Scr）控制siRNA对P27敲除的代表性蛋白质印迹和量化（n=3个独立实验，*p<0.05）。（C）EDU掺入和组蛋白H3磷酸化（PHH3）的代表性图像和量化，以检查在人类iPS-CM中引入2F的情况下，使用siRNA与2i相比击倒P27的效果（n=3个独立实验，*p<0.05）。（D）研究结果总结表明，四种细胞周期调节剂的组合可以在体内外诱导成熟心肌细胞的胞质分裂，从而修复受损的心脏。只有两种细胞周期调节因子（CDK4/CCND）和使用MK1775和使用SB431542的Tgf-β抑制Wee1，或使用siRNA敲低P27，都获得了类似的结果。
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中的注释

  • 再生：修复破碎的心灵。
    斯特齐兹·P。 斯特齐兹·P。 Nat Rev Mol细胞生物学。2018年5月；19(5):277. doi:10.1038/nrm.2018.18。Epub 2018年3月7日。 Nat Rev Mol细胞生物学。2018 采购管理信息：29511343 没有可用的摘要。
  • 再生：修补破碎的心。
    斯特齐兹·P。 斯特齐兹·P。 Nat Rev Cardiol公司。2018年5月；15(5):253. doi:10.1038/nrcardo.2018.30。Epub 2018年3月22日。 Nat Rev Cardiol公司。2018 采购管理信息：29565034 没有可用的摘要。
  • 内心年轻。
    谢柏芝，Kamp TJ。 Hsieh PCH等人。 细胞干细胞。2018年4月5日；22(4):475-476. doi:10.1016/j.stem.2018.03.003。 细胞干细胞。2018 采购管理信息：29625063

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