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.2018年3月1日；9(3):343.
doi:10.1038/s41419-018-0363-x。

薯蓣皂苷通过Akt/GSK3/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤干细胞样特性和肿瘤生长

刘威海 1, 赵志强 1, 王永谦 1, 李武国 2, 乔苏 2, 羌佳 三, 张家军 1, 张雪林 1, 沈京南 4, 尹俊强（音） 5
附属公司

薯蓣皂苷通过Akt/GSK3/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤干细胞样特性和肿瘤生长

刘威海等。 细胞死亡疾病. .

摘要

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨肿瘤。许多骨肉瘤患者对目前的化疗方案总是产生耐药性，导致预后不良。据报道，肿瘤干细胞具有自我更新和维持肿瘤表型的特性，这可能导致临床治疗失败。因此，开发几种可能有用的治疗药物是一项紧迫的任务，这些药物可以针对骨肉瘤中的CSC。本研究旨在阐明薯蓣皂苷的体外和体内抗骨肉瘤作用及其分子机制。在这项研究中，所有10个人骨肉瘤细胞系对薯蓣皂苷治疗均敏感，且呈剂量和时间依赖性。薯蓣皂苷抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞周期阻滞和凋亡细胞死亡。更重要的是，口服薯蓣皂苷（60 mg/kg）对骨肉瘤的生长具有显著的治疗效果，在体内没有明显的副作用。此外，薯蓣皂苷具有抑制骨肉瘤细胞干细胞样表型的能力。从机制上讲，薯蓣皂苷通过抑制Akt/GSK3/β-catenin途径抑制骨肉瘤干细胞样特性和肿瘤生长。此外，骨肉瘤患者β-catenin的表达与临床预后相关。综上所述，本研究为薯蓣皂苷通过抑制Akt/GSK3/β-catenin通路抑制骨肉瘤干细胞样特性和肿瘤生长提供了全面的证据，这表明薯蓣苷是一种有前景的治疗方案。β-catenin可能是骨肉瘤患者潜在的治疗靶点和重要的预后指标。

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数字

图1
图1。薯蓣皂苷抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡细胞死亡。
一薯蓣皂苷的化学结构。b条,c（c）薯蓣皂苷以剂量依赖性方式抑制骨肉瘤细胞（U2OS、U2OS/MTX300、HOS、MNNGHOS、143B、MG63、ZOS、ZOSM、SJSA1、G292）的活性。用不同浓度的薯蓣皂苷处理骨肉瘤细胞72 h、 MTT法检测细胞活力。计算并显示了IC50。d日薯蓣皂苷可减少骨肉瘤细胞的集落形成。薯蓣皂苷治疗10天后，检测骨肉瘤细胞（U2OS、U2OS/MTX300、ZOS、143B）的集落形成能力。e（电子）薯蓣皂苷在骨肉瘤细胞（U2OS，143B）中诱导G2/M期阻滞。用载体或2.5处理的骨肉瘤细胞的细胞周期分布 μ米薯蓣皂苷24 流式细胞术检测h。（f）,克薯蓣皂苷分别在qRT-PCR和western blot检测到的mRNA和蛋白水平上调P21的表达。小时经载体或2.5处理的骨肉瘤细胞（U2OS，143B）的Annexin V/PI染色 μ米薯蓣皂苷48 流式细胞术检测h。我western blot检测细胞凋亡指标（裂解PARP、Bcl-2和Bcl-xL）。薯蓣皂苷诱导PARP的分裂以及Bcl-2和Bcl-xL的下调。j个Hoechst染色显示较亮的蓝色染色和典型的凋亡形态学变化，包括2.5后U2OS和143B细胞的细胞核缩小和染色质凝集 μ米薯蓣皂苷治疗24例 h.比例尺，100 微米。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图2
图2。薯蓣皂苷抑制体内骨肉瘤异种移植物的生长。
一−c（c）检查肿瘤体积和重量以评估不同治疗的效果（Vehicle，Dioscin 60 mg/kg和ADM 6 mg/kg）。薯蓣皂苷口服给药，剂量为60 mg/kg每天。以6倍剂量腹腔注射ADM mg/kg，每周一次。数据代表平均值 ± 八只小鼠肿瘤体积和重量的SD。d日IHC染色小鼠肿瘤样本中的Bcl2、Ki67和PCNA，以检测薯蓣皂苷治疗诱导的体内凋亡水平及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。比例尺，100 微米。e（电子）对IHC染色强度（Bcl2、Ki67和PCNA）进行评分。薯蓣皂苷60 mg/kg显著降低体内Bcl2、Ki67和PCNA的表达。数据代表平均值 ± 8只小鼠IHC染色评分的SD。（f）薯蓣皂苷在治疗期间对小鼠体重的影响。数据代表平均值 ± 八只小鼠体重的SD**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图3
图3。薯蓣皂苷抑制骨肉瘤细胞的干细胞样特性。
一2.5天后分析U2OS和143B细胞的肉球形成能力 μ米薯蓣皂苷治疗。比例尺，100 微米。b条2.5天后，在不进行进一步处理的情况下，分析143B细胞的次生肉球形成能力 μ米薯蓣皂苷治疗原发性肉球形成试验。比例尺，100 微米。c（c）,d日用载体或2.5处理的U2OS和143B细胞中干细胞标记物（SOX2、OCT4、CD117、CD133和NANOG）的mRNA表达 μ米薯蓣皂苷48 用qRT-PCR检测h。e（电子）,（f）通过免疫荧光分析指示细胞中SOX2蛋白的表达。比例尺，10 微米。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图4
图4。薯蓣皂苷通过抑制Wnt/β-catenin途径靶向骨肉瘤样性质。
一用不同浓度的薯蓣皂苷处理U2OS和143B细胞48小时，检测CSC通路中三种关键蛋白（β-catenin、NICD1和GLI1）的表达 小时。b条用qRT-PCR方法检测了载体或2.5的U2OS细胞中Wnt/β-catenin途径（PPARD、AXIN2和MMP7）、Notch途径（HES1和CCND3）和Hedgehog途径（GLI1和HHIP）靶基因mRNA的表达 μ米薯蓣皂苷48 小时。c（c）载体或60治疗小鼠肿瘤标本中β-catenin、NICD1和GLI1的IHC染色 每天mg/kg薯蓣皂苷。比例尺，100 微米。d日用不同浓度的薯蓣皂苷处理U2OS细胞48小时，检测细胞溶质和核β-连环蛋白水平 小时。e（电子）通过免疫荧光分析用载体或2.5处理的143B细胞中β-连环蛋白的表达 μ米薯蓣皂苷48 h.比例尺，10 微米。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图5
图5。薯蓣皂苷对骨肉瘤干细胞样特性和肿瘤生长的抑制作用依赖于Wnt/β-catenin途径。
一western blot检测β-catenin-shRNA的效率。b条−d日薯蓣皂苷对增殖的影响很小(b条)，菌落形成(c（c）)和肉球的形成(d日)β-catenin敲除的骨肉瘤细胞。e（电子）western blot检测β-catenin过度表达的效率。（f）−小时薯蓣皂苷对细胞增殖的影响(（f）)，菌落形成(克)和肌球的形成(小时)骨肉瘤细胞中β-catenin的过度表达部分挽救了肿瘤。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图6
图6。β-catenin促进骨肉瘤细胞的增殖和干细胞样特性。
一−c（c）shRNA缺失β-catenin对增殖的影响(一)，菌落形成(b条)和球体形成(c（c）)进行了分析。d日−（f）β-catenin过度表达对细胞增殖的影响(d日)，菌落形成(e（电子）)和肉球的形成(（f）)进行了分析。比例尺，100 微米。克β-连环蛋白抑制剂ICG-001以剂量依赖的方式抑制骨肉瘤细胞（U2OS，143B）的活性。用不同浓度的ICG-001处理骨肉瘤细胞72 h、 MTT法检测细胞活力。小时ICG-001减少骨肉瘤细胞的集落形成。20天后检测骨肉瘤细胞（U2OS，143B）的集落形成能力 μ米ICG-001治疗10天。我分析了143B细胞在20 μ米ICG-001治疗。比例尺，100 微米。j个20天后，在不进行进一步处理的情况下，分析143B细胞的次生肉球形成能力 μ米原发性肉球形成试验中的ICG-001治疗。比例尺，100 微米。数据代表平均值 ± 三个独立实验的SD*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图7
图7。薯蓣皂苷主要通过阻断Akt和GSK3的磷酸化来抑制Wnt/β-catenin途径。
一用蛋白质印迹法检测了用不同浓度的薯蓣皂苷处理48小时的U2OS细胞中磷酸化Akt（Ser473）、总Akt、磷酸化GSK3α/β（Ser21/9）、总GSK3α/β和β-连环蛋白的水平 h.薯蓣皂苷以剂量依赖性方式阻断Akt和GSK3的磷酸化。b条用IHC染色法检测载体或薯蓣皂苷60治疗小鼠同一肿瘤标本中p-Akt（Ser473）、p-GSK3β（Ser9）和β-catenin的水平 mg/kg.比例尺，100 微米。c（c）对IHC染色强度（p-Akt（Ser473）、p-GSK3β（Ser9）和β-catenin）进行评分。薯蓣皂苷60 mg/kg显著降低体内p-Akt（Ser473）、p-GSK3β（Ser9）和β-catenin水平。数据代表平均值 ± 8只小鼠IHC染色评分的SD。d日,e（电子）用免疫荧光法分析用载体或2.5处理的U2OS和143B细胞中p-Akt（Ser473）、p-GSK3β（Ser9）和β-catenin的水平 μ米薯蓣皂苷48 h.比例尺，10 微米***第页 < 0.001（双尾学生）t吨测试，SPSS 20.0
图8
图8。骨肉瘤患者β-catenin表达临界值的定义及其预后价值。
一显示了骨肉瘤细胞系中β-连环蛋白的典型表达模式。显示β-catenin/GAPDH的比率。b条β-catenin蛋白表达与IC50呈负相关（μ米)在人骨肉瘤细胞系中（皮尔逊相关分析，第页 = 0.0331).c（c）western blot检测12对骨肉瘤组织及邻近正常肌肉组织中β-catenin的蛋白表达。计算β-catenin归一化为GAPDH的相对强度。β-catenin在人骨肉瘤组织中的表达水平显著高于正常肌肉组织（配对t吨测试，第页 < 0.001).d日免疫组织化学染色检测骨肉瘤组织中β-catenin蛋白的表达(n个 = 107). 图中显示了β-catenin低表达和高表达的典型图像。比例尺，100 微米。e（电子）,（f）通过受试者操作特征（ROC）曲线确定骨肉瘤中β-catenin表达的临界值。对于骨肉瘤患者的生存状态和肺转移状态，绘制了敏感性和1-特异性。曲线下面积（AUC）和第页显示了值。克低β-catenin表达组的总体生存率显著高于对照组（log-rank检验，第页 = 0.0178).小时β-catenin高表达组的肺转移风险明显较高（log-rank检验，第页 = 0.0082)
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