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.2018年3月15日；37（6）：e97822。
doi:10.15252/embj.201797822。 Epub 2018年3月1日。

类朊蛋白聚集体利用RHO GTPase到cofilin-1信号通路进入细胞

甄忠 1, 劳拉·格拉索 1, 卡罗琳·西比拉 1, 蒂姆·J·史蒂文斯 1, 尼古拉斯·巴里 1, 安妮·贝托洛蒂 2
附属公司

类朊蛋白聚集体利用RHO GTPase到cofilin-1信号通路进入细胞

甄忠等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

蛋白质聚集是多种神经退行性疾病的标志。多行证据表明，蛋白质聚集体可以渗透到细胞内并像朊病毒一样扩散。这些聚集物如何进入细胞仍不清楚。通过聚焦siRNA筛选与膜转运相关的基因，我们发现突变SOD1聚集体，像病毒一样，利用cofilin-1重塑皮层肌动蛋白并进入细胞。cofilin-1上游，来自RHO GTPase和ROCK1及LIMK1激酶的信号控制cofilin1活性，以重塑肌动蛋白并调节聚集进入。在症状性SOD1的脊髓中G93A公司转基因小鼠cofilin-1磷酸化增加，肌动蛋白动力学改变。重要的是，RHO到cofilin-1的信号通路也调节tau和α-突触核蛋白聚集体的进入。我们的结果确定了一种常见的宿主细胞信号途径，不同的蛋白质聚集体利用该途径重塑肌动蛋白并进入细胞。

关键词：肌动蛋白；聚集；科菲林；神经退行性疾病；朊病毒。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。无偏见的高内容屏幕识别聚合条目的修饰符

  1. 表示实验工作流的方案。

  2. 组合Z轴‐每个siRNA敲除或模拟转染的得分，以散点图表示x个指示筛选井的轴。Z轴得分高于2.0的得分用橙色表示，低于−2的得分用蓝色表示。水平线表示Z轴评分阈值（±3.8）用于二次筛选，选择15个最重要的候选基因。

  3. 接种0.8μM Dylight‐650‐SOD1后16 h 293T细胞的流式细胞术分析H46R型骨料。在细胞接种聚集体前3天，用指示的siRNA或对照（CTRL）siRNA转染细胞。通过流式细胞术测量每个样品10000个细胞的荧光强度(n个 = 2–5).

  4. 接种0.8μM Dylight‐650‐SOD1 1 h后SK‐N‐AS细胞的流式细胞术分析H46R型聚集体和转染指示的siRNA后3天。通过流式细胞术测量每个样品10000个细胞的荧光强度(n个 = 3–10).

数据信息：数据是指±SEM*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01. ***P（P）≤ 0.001. ****P（P）≤ 0.0001. 结果通过普通单向方差分析进行分析，然后进行多重比较。可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。siRNA屏幕的代表性图像

  1. 使用尼康高含量显微镜（20×0.75 NA物镜）从siRNA屏幕上提取的代表性原始图像样本。上排：用Dylight‐650标记的SOD1聚集体处理16小时的293T细胞的三通道图像中的子区域。样品与H33342（蓝色）共同染色以显示细胞核，CellMask（绿色）显示质膜。下一行：使用尼康NIS‐Elements一般分析的图像分割结果。细胞内的聚集物被识别为绿点。CellMask揭示了质膜的轮廓，人工将其着色为紫色边界。黄色点是被拒绝的点，要么是细胞外的聚集物，要么包含饱和像素。红圈线勾勒出细胞核。比例尺：50μm。

  2. 用对照（CTRL）siRNA、PCALM siRNA或RAB5C siRNA转染293T细胞3天后的高含量图像，并用H33342（蓝色）染色以显示细胞核，CellMask绿色质膜染色（绿色）。用Dylight‐650标记的SOD1聚集体（红色）流动接种16小时后，固定细胞并成像。比例尺：50μm。

图EV2
图EV2。siRNA筛选程序概述

  1. 上部面板：颜色矩阵表示组合Z轴在原始孔板网格位置重建的每个siRNA敲除的得分（每个细胞的蛋白质聚集物归一化为对照）。

  2. 前15个基因的siRNA筛选结果摘要。点击率根据组合的绝对值进行排名Z轴分数（屏幕1–4），根据实验重复（屏幕1、屏幕2、屏幕3和屏幕4）的平均值进行标准化。P（P）值是获得组合值的估计概率Z轴‐分数；细胞计数对应于细胞计数的平均值Z轴‐四项独立生物实验的得分。

  3. siRNA筛选验证策略概述。

  4. 在二级屏幕中，每次点击修改SOD1聚合条目的单个siRNA数量（共4个）。

图EV3
图EV3。共聚焦图像显示SOD1聚集体在胰蛋白酶化后和FACS分析前位于细胞内
接种Dylight‐650标记的SOD1聚集体后2小时，对SK‐N‐AS细胞进行胰蛋白酶消化并固定。使用蔡司710共焦显微镜（卡尔蔡司有限公司）通过63倍物镜聚焦细胞核层获得图像，以确保图像能够可视化细胞内容。比例尺：10μm。
图EV4
图EV4。筛选出的五种修饰体的siRNA敲除
转染所示siRNA后2天，通过定量RT-PCR测定mRNA水平。数据为平均值±SEM(n个 ≥ 2). 普通单向方差分析，然后进行多重比较****P（P）≤ 0.0001.可在线获取此图的源数据。
图EV5
图EV5。SOD1聚合条目的修改器
接种0.8μM Dylight‐650‐SOD1后16 h的SK‐N‐AS细胞流式细胞术分析H46R型聚集体和转染指示的siRNA后3天。通过流式细胞术测量每个样品10000个细胞的荧光强度。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 普通单向方差分析，然后进行多重比较***P（P）≤ 0.001, ****P（P）≤ 0.0001.可在线获取此图的源数据。
图EV6
图EV6。RAB5击倒后SOD1骨料摄取
接种0.8μM Dylight‐650‐SOD1 1 h后SK‐N‐AS细胞的流式细胞术分析H46R型聚集体和转染指定siRNA后3天。数据为平均值±SEM(n个 ≥ 2). 通过流式细胞术测量每个样品10000个细胞的荧光强度，并通过普通单向方差分析进行分析，然后进行多重比较**P（P）≤ 0.01.可在线获取此图的源数据。
图2
图2。从RHO到cofilin‐1的信号控制总进入细胞
  1. A类

    卡通描绘了RHO‐ROCK1，LIMK1到cofilin‐1（CFL1）的信号通路。

  2. B类

    转染ROCK1 siRNA或对照siRNA后3天，SK‐N‐AS细胞裂解液中指示蛋白的免疫印迹。

  3. C类

    （B）三份的定量。该图描述了与对照siRNA处理相比，ROCK1 siRNA敲除的细胞中磷酸辅酶-1（pCFL1）相对于总CFL1的水平。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款t‐测试。双尾**P（P） = 0.0043.

  4. D类

    用CT04或载体（CTRL）处理的SK-N-AS细胞裂解液中指示蛋白质的免疫印迹。

  5. E类

    （D）复制品的数量。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款时间测试。双尾***P（P） = 0.0003.

  6. F、 G公司

    与Y27632的（D，E）相同。数据为平均值±SEM(n个 = 4). 未付款t‐测试。双尾**P（P） = 0.0081.

  7. H（H）

    用pTGSH‐LIMK1或空载体转染2天后SK‐N‐AS细胞裂解液中指示蛋白的免疫印迹。

  8. 我

    （H）重复的定量。数据为平均值±SEM(n个 = 4). 未付款t‐测试。双尾**P（P） = 0.0021.

  9. J、 K（K）

    接种0.8μM Dylight‐650‐SOD1 1 h后SK‐N‐AS细胞的流式细胞术分析H46R型骨料，然后用1μg/ml CT04（J）或10μM Y27632（K）或载体（CTRL）处理15小时。数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3). 未付款t‐测试。双尾P（P）CT04和Y27632治疗的值分别为0.0001和0.0097。

  10. L（左）

    在接种标记的SOD1聚集体前2天，对转染pTGSH‐LIMK1或空载体作为对照的SK‐N‐AS细胞的聚集体摄取进行流式细胞术分析。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款t‐测试。双尾**P（P） = 0.0064.

  11. M（M）

    在1μg/ml CT04或10μM Y27632或聚集前1 h添加载体（CTRL）的情况下，接种初级神经元聚集物后1 h的聚集物摄取流式细胞术分析。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款时间测试。双尾P（P）CT04和Y27632治疗的值分别为0.0009和0.0254。

数据信息：代表性结果如（B、D、F、H）所示。在（J–M）的LSRFortessaTM（BD Biosciences）上，通过流式细胞术对每个样本10000个细胞的荧光强度进行测量。可在线获取此图的源数据。
图3
图3。Cofilin‐1控制皮质肌动蛋白，这是SOD1聚集物进入的屏障
  1. A类

    用cofilin-1（CFL1）siRNA或对照siRNA转染293T细胞3天后的共焦图像，用H33342（蓝色）染色以显示细胞核、抗CFL1抗体（绿色）和指骨蛋白（红色）以显示肌动蛋白丝。比例尺：10μm。

  2. B类

    分离细胞裂解物，然后进行免疫印迹，以显示F‐actin、G‐actim。分析前3天，用对照或CFL1 siRNA转染SK‐N‐AS细胞。

  3. C类

    （B）复制品的数量。该图描述了转染或不转染CFL1 siRNA的细胞中F‐actin/G‐actin比率的水平。数据为平均值±SEM(n个 = 4). 未付款t‐测试。双尾**P（P）=0.0068。

  4. D、 E类

    与（B，C）中相同，但细胞转染了对照或ROCK1 siRNA。数据为平均值±SEM(n个=2）。未付款t‐测试。双尾**P（P） = 0.0046.

  5. F类

    分离SK‐N‐AS细胞裂解物，然后进行免疫印迹，以显示F‐actin和G‐actim。裂解前，用1μg/ml CT04或10μM Y27632处理细胞16 h。

  6. G公司

    重复实验的量化，如（F）所示。数据为平均值±SEM(n个 = 4). 未付款t‐测试。双尾P（P）CT04和Y27632治疗的值分别为0.0083和0.0043。

  7. H（H）

    用载体（DMSO）或25 nM茉莉花碱内酯处理16小时后，SK-N-AS细胞分馏裂解物中F‐actin、G‐actim和总actin的免疫印迹。

  8. 我

    用0.8μM Dylight‐650‐SOD1接种SK‐N‐AS细胞后1 h，对聚集物进入进行流式细胞术分析H46R型用载体（DMSO）或25 nM茉莉酮内酯处理16 h后的骨料。通过流式细胞术测量每个样品10000个细胞的荧光强度(n个 = 2). 数据为平均值±SEM。未付款t‐测试。双尾*P（P）=0.0155。

  9. J型

    卡通描绘了RHO对CFL1通路的行为重塑调控。

数据信息：显示了具有代表性的结果。（C、E、G、I）*P（P）≤ 0.05, **P（P）≤ 0.01.可在线获取此图的源数据。
图4
图4。SOD1聚集体瞬时改变细胞中的cofilin‐1磷酸化

  1. 接种SOD1聚集体指定时间的SK‐N‐AS细胞裂解物中指定蛋白质的免疫印迹。

  2. （A）一式三份的数量。该图描述了SOD1聚集体接种SK-N-AS细胞期间pCFL1相对于总CFL1的水平。

  3. 用右旋糖酐（Mr 10000）接种SK‐N‐AS细胞指定时间后，用指定抗体进行免疫印迹分析。

  4. 三份（C）的数量。该图描述了葡聚糖（Mr 10000）接种SK‐N‐AS细胞期间pCFL1相对于总CFL1的水平。

数据信息：显示了具有代表性的结果。（B，D）普通单向方差分析，然后进行多重比较(n个 = 3). 未注明：P（P）>0.05时***P（P）≤ 0.001. ****P（P）≤ 0.0001.可在线获取此图的源数据。
图5
图5。SOD1聚集体改变SOD1中的cofilin‐1磷酸化G93A公司转基因小鼠

  1. 脊髓SOD1裂解物中指示蛋白的免疫印迹G93A公司4至20周龄的转基因小鼠或野生型小鼠。

  2. 免疫印迹中pCFL1/CFL1比率的定量，如（A）所示。该图描述了SOD1脊髓腰段pCFL1相对于总CFL1的水平G93A公司与野生型相比。数据为平均值±SEM(n个 = 4). 未付款t‐测试。双尾P（P）每个年龄组的值分别为0.2359、0.0363和0.0376。

  3. 肌动蛋白分级，然后对SOD1脊髓裂解物进行免疫印迹G93A公司转基因或野生型小鼠（20周龄）。

  4. 免疫印迹上F‐actin/G‐actin比率的定量，如（C）所示。该图描述了SOD1脊髓腰段F‐actin/G‐actin比率的水平G93A公司20周时与野生型相比。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款t‐测试。双尾***P（P） = 0.0004.

  5. SOD1全脑裂解物中指示蛋白的免疫印迹G93A公司转基因或野生型小鼠（20周龄）。

  6. 免疫印迹上pCFL1/CFL1比率的定量，如（E）所示。该图描述了SOD1患者大脑中pCFL1相对于总CFL1的水平G93A公司20周时与野生型相比。数据为平均值±SEM(n个 = 5). 未付款t‐测试。双尾P（P） = 0.8644.

数据信息：代表性结果如（A、C、E）所示。可在线获取此图的源数据。
图6
图6。RHO至cofilin‐1信号通路调节不同蛋白质聚集体的进入
  1. A类

    用0.1μM Dylight‐650‐α-synuclein聚集体接种SK‐N‐AS细胞后，以及用指示的siRNA转染3天后，对聚集体进入进行流式细胞术分析。通过流式细胞仪对每个样品10000个细胞的荧光强度进行测量(n个 = 3). 普通单向方差分析，然后进行多重比较****P（P）≤ 0.0001.

  2. B、 C类

    流式细胞术分析α-synuclein聚集体摄取，如（A）所示，但SK‐N‐as细胞用1μg/ml CT04（B）或25 nM Jasplakinolide（C）处理16 h。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款t‐测试。双尾P（P）CT04和Jasplakinolide治疗的值分别为0.0073和0.0159。

  3. D类

    接种0.06μM Dylight‐650‐tau聚集体和转染指定siRNA后3天，对SK‐N‐AS细胞进行流式细胞术分析。通过流式细胞仪测量每个样品10000个细胞的荧光强度(n个 = 3). 普通单向方差分析，然后进行多重比较***P（P）≤ 0.001, ****P（P）≤ 0.0001.

  4. E、 F类

    与具有tau聚集体的（B和C）中相同。数据为平均值±SEM(n个 ≥ 3). 显示了具有代表性的结果。数据为平均值±SEM(n个 = 3). 未付款t‐测试。双尾P（P）CT04和Jasplakinolide治疗的值分别为0.0001和0.0232。

  5. G公司

    Rho到cofilin‐1信号通路被蛋白质聚集体利用，重塑为皮质肌动蛋白，从而使细胞进入。

数据信息：在（A–F）中，通过流式细胞术在LSRFortessaTM（BD Biosciences）上对每个样本的10000个细胞测量荧光强度。可在线获取此图的源数据。
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