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.2018年1月5日；9(9):8548-8559.
doi:10.18632/目标24013。 eCollection 2018年2月2日。

肿瘤靶向抗癌蛋白药物的细胞质量依赖性表达沙门氏菌

Kwangsoo Kim先生 1 2, Sa-Young Min公司 三, Ho-Dong Lim公司 三, 宋焕友 三, 大津林 1 2, Jae-Ho Jeong公司 1 2, 金贤珠 1 2, Joon Haeng Rhee先生 1 2, 京畿道公园 1 2, 申敏生 4, 金敬中（Geun Joong Kim） 三, 郑俊敏 2 5, Hyon E Choy公司 1 2
附属机构

肿瘤靶向抗癌蛋白药物的细胞质量依赖性表达沙门氏菌

Kwangsoo Kim先生等。 Oncotarget公司. .

摘要

细菌癌症治疗依赖于某些细菌种类的特性，这些细菌能够在实体恶性肿瘤中靶向和增殖。如果这些细菌能够装载抗肿瘤蛋白，那么这种方法的疗效将大大提高。然而，由于大多数抗肿瘤蛋白对正常组织也有毒性，它们必须由特异性靶向并仅定位于肿瘤组织的细菌表达。作为治疗实体恶性肿瘤的一种策略，我们最近评估了肿瘤靶向递送的L-天冬酰胺酶（L-ASNase）沙门氏菌在该系统中，L-ASNase在阿拉巴德发起人(PBAD公司)的大肠杆菌阿拉伯糖操纵子，由注射L-阿拉伯糖诱导。在这里，我们进一步提高了重组的性能沙门氏菌在癌症治疗中，通过利用quorum-sensing（QS）系统，该系统使用细胞质量依赖的自诱导逻辑。这种方法避免了监测肿瘤内细菌状态和通过施用外源性化合物诱导货物蛋白表达的必要性。重组沙门氏菌在肿瘤中以细胞质量依赖的方式表达和分泌活性L-ASNase，产生显著的抗癌作用。这些结果表明，在QS系统控制下表达治疗性蛋白是生产重组蛋白的一个有希望的工程平台体内.

关键词：L-天冬酰胺酶；细菌性肿瘤治疗；配额制度；沙门氏菌。

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利益冲突声明

利益冲突作者没有任何利益冲突。

数字

图1
图1。生长期间携带pQSRI-mCherry、pQSI-mCherry或pQSR-mCherry-的∆ppGpp沙门菌中mCherry-reporter基因的表达在体外
(A类)质粒构建物携带mCherry，受QS元件、LuxR和/或LuxI的各种组合控制。(B类)LB中的细菌生长（CFU/ml）与时间（小时，小时）的关系（左侧面板）。通过荧光测定法（右图）和Western blotting（底图）测定LB中细菌的mCherry表达。为了检测mcherry，我们对每个样品使用20µg纯化蛋白。阳性对照（P.C）是PQSRI-mcherry的样品（12小时）。(C类)沙门氏菌携带pQSRI-mCherry，在LB中生长，如所示（图1B，左图），在所示时间取样，染色，并在荧光显微镜下成像。蓝色表示DAPI染色，红色表示mCherry。微分干涉对比（DIC）显微图像沙门氏菌包括在内。比例尺，10µm。(D类)mCherry-expressing公司沙门氏菌可视化定量（每个样本>5个字段），并绘制成培养时间的函数。(E类)通过∆ppGpp表达mCherry沙门氏菌通过荧光测定法测定LB中含有或不含有AHL的pQSRI-m樱桃或pQSR-m樱桃。沙门氏菌携带pQSR-mCherry作为对照。星号(*)面板B和D中显示与pQSI-mCherry相比存在显著差异(***P（P）< 0.0001).
图2
图2。在小鼠肿瘤模型中通过quorum-sensing启动子表达mCherry(n个= 3)
(A类)通过测定CFU，在指定的天数对肝脏、脾脏和肿瘤组织中的细菌进行计数。(B类)肿瘤内mCherry的表达沙门氏菌在指定的dpi下，通过荧光显微镜检测到携带pQSRI-m樱桃。mCherry（红色）在肿瘤组织中的表达在沙门氏菌每个样本中都有一个特定的抗体（绿色）和带有DAPI（蓝色）的细胞核。比例尺，20µm。
图3
图3。生长期间携带pQSR-ASNase、pQSI-ASNace或pQSRI-ASNase的∆ppGpp沙门菌中L-ASNase表达在体外
(A类)在QS元件、LuxR和/或LuxI的不同组合的控制下携带ASNase的质粒构建体。(B类)沙门氏菌携带指示质粒的细菌在LB中生长，并采集细菌样本（颗粒）通过Western blotting分析L-ASNase的表达。最后一行显示L-ASNase分泌自沙门氏菌携带pQSRI-ASNase进入培养基（上清液）。(C类)L-ASNase活性来自沙门氏菌携带指示的质粒。星号(*)表明与pQSI-mCherry的显著差异(***P（P）= 0.0005,****P（P）< 0.0001). (D类)沙门氏菌在LB（携带pQSRI-ASNase的细菌）或在LB中添加或不添加0.2%L-阿拉伯糖（携带P坏：：ASNase）。收集等量的细菌培养物，分离成颗粒和上清液组分，并通过Western blotting（上面板）或分析试剂盒（仅上清液；下面板）分析L-ASNase。星号(*)显示与pBAD24质粒的显著差异（模拟）(***P（P）= 0.0004,****P（P）< 0.0001).
图4
图4。携带pQSRI-ASN、pQSI-ASN或pQSR-ASNe的沙门氏菌分泌的L-ASNase的细胞毒性作用
(A类和B类)沙门氏菌携带指示质粒在LB中培养9小时。分离细菌上清液并浓缩至200 mg/ml。用上清液处理MC38细胞24小时，并通过MTT分析[A]和TUNEL分析[B]测定细胞活力。星号(*)显示与模拟的显著差异(***P（P）= 0.0004). (C类)TUNEL阳性细胞的定量。Mock与沙门氏菌携带载体pBAD质粒。星号(*)表明与Mock或pQSR-ASN和pQSI-ASN相比存在显著差异(***P（P）= 0.0005).
图5
图5。携带pQSRI-ASNase或pQSR-ASNase的沙门氏菌的抗肿瘤作用体内
抗肿瘤作用沙门氏菌(1 × 107使用移植到C57BL/6小鼠的MC38肿瘤检测携带指示质粒的CFU(n个=每个治疗7次）。PBS治疗作为阴性对照(n个= 7). (A类)具有代表性的大体形态变化。(B类)细菌治疗后肿瘤大小的变化。误差条对应95%置信区间（CI）。星号(*)表明与PBS治疗相比存在显著差异(***P（P）= 0.006). (C类)MC38肿瘤小鼠的Kaplan−Meier生存曲线。星号(*)表明与PBS治疗相比存在显著差异(*P（P）= 0.01,**P（P）= 0.0013,***P（P）= 0.0003).
图6
图6。现场在小鼠肿瘤模型中通过quorum-sensing启动子表达L-ASNase
L-ASNase在小鼠体内的表达沙门氏菌通过Western blotting在1和5dpi下分析携带pQSRI-ASNA酶(n个=每组4人(A类)或通过免疫荧光显微镜（80倍放大）(B类). 绿色表示沙门氏菌红色表示L-ASNase。比例尺，50µm。
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