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.2018年2月1日；32(3-4):297-308.
doi:10.101/gad.310896.117。 Epub 2018年2月26日。

转录延伸率影响组蛋白前体mRNA的新生折叠和3'末端加工

塔萨·萨尔迪 1, 新丰 1, 大卫·L·本特利 1
附属公司

转录延伸率影响组蛋白前体mRNA的新生折叠和3'末端加工

塔萨·萨尔迪等。 基因开发. .

勘误表in

摘要

转录延伸率影响共转录前mRNA成熟，但这种动力学耦合是如何工作的尚不清楚。非腺苷酸化组蛋白信使核糖核酸3’端的形成需要通过干环结合蛋白（SLBP）识别RNA结构。我们报告说，突变RNA聚合酶II（Pol II）的慢转录导致多聚腺苷化组蛋白mRNA的积累，这些mRNA延伸到干环加工位点。紫外线照射会减缓Pol II的伸长，也会诱导长聚（A）+组蛋白转录本。慢Pol II抑制3'加工与组蛋白基因招募SLBP失败相关。对新生RNA结构的化学探测表明，干环在慢Pol II生成的转录物中无法折叠，从而解释了SLBP的缺失和3'末端的处理失败。这些结果表明，转录速度的调节可以通过改变初生RNA的结构来调节前mRNA的加工，并提出了一种控制替代加工的机制。

关键词：共转录RNA折叠；组蛋白mRNA 3′端加工；动力学耦合；茎环结合蛋白；转录延伸率。

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数字

图1。
图1。
Slow Pol II生产3′延伸聚乙烯（A）+组蛋白转录本。(A类)高架聚乙烯（A）+R749H慢突变体中的RD组蛋白mRNA。两个重复的RNA-seq读数的折叠变化（FDR由DESeq2确定）。（无信号）FDR>0.05。(B类)poly（A）的集成基因组查看器（IGV）基因组浏览器屏幕截图+RNA序列。基因从左到右排列。比例标准化为每个库的总映射读取数。请注意，R749H中的组蛋白转录物升高并延伸到正常的3′端以外（红色箭头）。H2AFZ是一种非复制组蛋白mRNA控制（另请参见补充图S1A、B). 中的数据A类和B类来自基因表达综合（GEO）GSE63375（Fong等人，2014）。(C类)3′延伸poly（A）的qRT-PCR+组蛋白mRNA。(天)所选RD组蛋白mRNA的3′RACE。注意R749H慢突变体中远端多聚（A）位点的使用增加。(E类)所选组蛋白基因3′RACE产物的qRT-PCR证实R749H中远端poly（A）位点的使用增加。(*)P（P）<0.05，学生t吨-从三个生物复制品中进行测试。中的误差线C类和E类表示SEM。
图2。
图2。
慢Pol II导致RD组蛋白基因下游的阅读转录。(A类)反Pol II tNetSeq的截图显示野生型和慢突变体R749H和H1108Y，如图1B所示。比例标准化为总映射读取数。注意慢突变体中的阅读转录增加。(B类)平均组蛋白tNetSeq信号的Metaplot显示慢突变体中的通读转录增加（红色箭头）。中的结果A类和B类来自GEO GSE97827（Fong等人，2017）。
图3。
图3。
慢Pol II阻止SLBP向组蛋白基因募集。(A类)将SLBP ChIP-seq信号的IGV截图归一化为野生型和R749H组蛋白基因的总定位读码。注意R749H中SLBP信号的丢失。(B类)野生型和R749H中平均SLBP ChIP信号的Metaplot（50-bp bins）。(C类)以抗SLBP和α-微管蛋白作为负荷对照，对总蛋白进行Western blot检测。注：用强力霉素（Dox）和α-阿曼替丁（α-Am；45 h）处理后，表达野生型和R749H突变型Pol II的细胞中SLBP的表达大致相等。(天)组蛋白基因上NELF-A ChIP-seq信号的Metaplot显示野生型和慢R749H突变体的定位。(E类)组蛋白基因上CstF77 ChIP信号的Metaplots显示慢突变体（红色箭头）中的占有率发生了5′移动。(F类)加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）基因组浏览器对RD组蛋白基因CstF77 ChIP-seq的截图。注意R749H中CstF77密度的5′位移（红色箭头）和下游远端poly（A）位点密度的增加（紫色箭头）。
图4。
图4。
RNA结构的化学探测。(A类)Pol II新生转录物的SHAPE-MaP探测。(B类)用来自野生型和R749H表达细胞的DMS或1M7处理的抗Pol II免疫沉淀中18S rRNA（1-450）的归一化反应性。18S rRNA是用作阴性对照的免疫沉淀中的污染物。注意野生型的1M7和DMS处理与R749H突变体之间的密切一致，正如预期的那样，因为rRNA是由Pol I转录的(C类)SHAPE-MaP数据映射到人类18S rRNA的结构上（Cannone等人，2002年）。只有反应性大于0.3%的碱才被视为反应性碱，并用红色标记。由于DMS仅针对As和Cs，因此仅显示这些碱。星号表示在特征结构中碱基配对的区域，并且在我们的核提取物免疫沉淀中对1M7和DMS都有反应。
图5。
图5。
慢转录破坏组蛋白3′SL的结构(A类)测定了30个组蛋白基因的组蛋白3′SL一致序列。（M） 信用证；（Y） C/U。茎以绿色突出显示，SLBP结合所必需的不变碱基以红色突出显示(B类,C类)30个表达良好的组蛋白基因对DMS或与野生型和R749H Pol II相关的新生RNA中的1M7的联合反应性（修饰归一化为未处理对照的百分比）。虚线对应于反应性阈值，定义为高于平均反应性的一个标准偏差（见材料和方法）。请注意，在正常碱基配对区域（红色箭头）的慢突变中反应性增加，而在茎的保守A残基5′中反应性降低（蓝色星号）。
图6。
图6。
紫外线照射诱导的缓慢伸长率上调poly（A）的读数+组蛋白转录本。(A类)紫外线照射减慢Pol II转录，诱导产生3′延伸聚（A）+RD组蛋白转录物。poly（A）的折叠变化+RNA-seq从两个重复实验中读取（黑色条；由DESeq2测定的FDR<0.05）。(B类)poly（A）的IGV截图+未经处理的人成纤维细胞（UT）以及紫外线照射后8和24小时的RNA-seq。比例标准化为总映射读取数。注意，紫外线照射后，聚（A）+组蛋白转录物升高并延伸到正常3′端以外。中的结果A类和B类来自GEO GSE91012（Williamson等人，2017年）。(C类)延伸率依赖组蛋白mRNA 3′末端形成模型，显示了一种假想的替代结构。
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